陸 娟，蘇利梅，胡名揚(yáng)，唐 俊

( 阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽阜陽 236037)

植物根際促生菌( plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR) 是指可以促進(jìn)植物生長、防治病害、增加作物產(chǎn)量的根際微生物，主要包括假單胞菌、芽孢桿菌、農(nóng)桿菌等20 多個種屬的微生物[1]。普遍認(rèn)為PGPR 的促生機(jī)制主要包括: (1)產(chǎn)生吲哚乙酸( IAA)、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯等調(diào)節(jié)植物生長的信號物質(zhì)[2，3]; (2) 進(jìn)行非共生固氮[4]; ( 3) 通過產(chǎn)嗜鐵素[5]、抗生素[6]和氰化物[7]抵抗病原菌;(4)溶解磷礦物及其它養(yǎng)分[8-10]。目前，已有從玉米[11]、櫻桃[12]、棉花[13]、小麥[14]、香蕉[15]、燕麥[16]等植物根際分離篩選出PGPR 的報道。2010 年，康貽軍等從多地土壤樣品中篩選出14 株P(guān)GPR，它們具有體外抑菌、產(chǎn)NH3、產(chǎn)IAA、產(chǎn)HCN、產(chǎn)嗜鐵素、解磷、溶鉀、固氮以及產(chǎn)抗生素等多種促生能力[17]。生長素是一類含有一個不飽和芳香族環(huán)和一個乙酸側(cè)鏈的內(nèi)源激素，常指吲哚乙酸，是最早發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)植物生長的激素。本研究從芝麻根際篩選具有產(chǎn)IAA 能力的促生菌并進(jìn)行分子鑒定，豐富了植物根際促生菌資源庫，并為進(jìn)一步開展生長素產(chǎn)生的相關(guān)機(jī)理研究及開發(fā)微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

芝麻根取自阜陽師范學(xué)院操場后的芝麻地。

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

鑒定培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，L-色氨酸100 mg，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 Salkowski 比色液的配制

先向50 mL 蒸餾水中加入1 mL FeCl3溶液(0.5 mol/L)，再緩緩加入30 mL H2SO4溶液(98%)，輕輕攪拌均勻備用。

1.4 方法

1.4.1 芝麻根際微生物的分離純化

無菌操作稱取芝麻根及附著土壤1 g，無菌水沖洗2 ～3 次，放入99 mL 無菌水中，充分振蕩15 min，靜置3 ～5 min 后得10－1的土壤懸濁液，10 倍梯度稀釋，各吸取0.1 mL 稀釋液涂布于細(xì)菌培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取不同類型的單菌落多次劃線培養(yǎng)進(jìn)行純化，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌株產(chǎn)IAA 能力的測定

分別將分離純化的菌株接種于含有L-色氨酸的鑒定培養(yǎng)基中，37 ℃、185 r/min 培養(yǎng)24 h。測量并調(diào)各菌懸液的OD530值為0.5。取各菌懸液1 mL分別放入無菌試管中，再加入Salkowski 比色液1 mL，室溫避光保存1 h 后觀察，以無菌水為陰性對照，顏色變紅者，表明能產(chǎn)生IAA，顏色越紅產(chǎn)IAA的能力越強(qiáng)。

1.4.3 菌株SA4 對黃瓜種子和玉米種子的促生作用

從根際微生物中篩選出具有產(chǎn)IAA 能力的菌株7 株，其中菌株SA4 產(chǎn)IAA 的能力最強(qiáng)。挑取SA4 單個菌落接種于鑒定培養(yǎng)基中，37 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h，5 000 r/min 離心4 min，棄上清，加入無菌水20 ml，振蕩2 ～3 min，重復(fù)離心、加水、振蕩3次，將菌轉(zhuǎn)移到200 ml 無菌水中，制成菌懸液，測菌懸液OD600，并調(diào)整至0. 4 ～0. 5 的范圍內(nèi)[18]。在已滅菌培養(yǎng)皿的濾紙上放入15 粒黃瓜種子，并加入菌懸液5 mL，以無菌水為對照，每隔24 h 向各培養(yǎng)皿中加入菌懸液或無菌水1 mL。分別于48 h、72 h、80 h 時測黃瓜主根根長，并在80 h 時測其根總重量。每組重復(fù)3 次。菌株SA4 對玉米種子的促生作用操作類似于對黃瓜種子的促生作用，僅玉米種子粒數(shù)(10 粒)、后期菌液和無菌水添加量(2 mL)、測定時間( 培養(yǎng)第7 d 時測其主根根長及根重)不同。

1.4.4 菌株SA4 的初步鑒定

常規(guī)鑒定:將菌株SA4 在細(xì)菌培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

16S rRNA 基因序列的測定與分析: 提取菌株SA4 基因組，以通用引物(27f:5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492r:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，50 μL 的PCR 反應(yīng)體系含有:PCR buffer 25 μL，200 nmol /L dNTPs 1 μL，正向引物反向引物各2 μL，模板1 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，MgCl23 μL，超純水15 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性1 min;94 ℃變性30 s，67 ℃退火30 s，72℃延伸2 min，34 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠( EB 染色) 電泳檢測。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，并利用BLASTN軟件進(jìn)行序列分析，尋找具有較高同源性的16S rRNA 序列，采用mega 5.0 進(jìn)行多序列比對，用鄰近法構(gòu)建16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻根際微生物的分離純化與產(chǎn)IAA 能力的測定

從芝麻根際分離篩選出7 株菌株，依次命名為SA1、SA2、SA3、A4、SA5、SA6、SA7。分別將7 株菌株接種于含有L-色氨酸的鑒定培養(yǎng)基中培養(yǎng)、調(diào)OD530，用Salkowski 比色液進(jìn)行各菌株產(chǎn)IAA 能力的測定，得出菌株SA4 的顏色最紅，即該菌株產(chǎn)IAA 的能力最強(qiáng)。

2.2 菌株SA4 對黃瓜種子和玉米種子的促生作用

黃瓜種子和玉米種子經(jīng)過菌株SA4 處理后，主根生長明顯( 圖1)。黃瓜種子在經(jīng)過菌株SA4 處理80 h 后，主根的長度約是對照組的3 倍，總根重約是對照組的2 倍;玉米種子在經(jīng)過菌株SA4 處理7 d 后，主根的長度約是對照組的3 倍，總根重也約是對照組的3 倍(圖2、表1)。結(jié)果表明，菌株SA4對黃瓜種子和玉米種子具有明顯的促生作用。

圖1 菌株SA4 對(A)黃瓜種子和(B)玉米種子的促生作用

圖2 菌株SA4 對黃瓜主根根長的影響

表1 菌株SA4 對黃瓜根重和玉米根長、根重的影響

2.3 菌株SA4 的初步鑒定

菌株SA4 菌落為淡黃色，較為干燥( 圖3-A);革蘭氏染色結(jié)果表明SA4 菌呈紅色短桿狀( 圖3-B)，屬于革蘭氏陰性菌。

圖3 (A)菌株SA4 菌落形態(tài)及(B)革蘭氏染色

將提取的基因組進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4-A，提取的SA4 基因組片段大小約23 kb;以該基因組為模板，采用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物大小約為1.5 kb( 圖4-B)，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，所得序列已提交至Genebank(登錄號為KR138702); 并將測得的序列通過BLASTN 軟件進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示菌株SA4 屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，與假單胞菌屬基因序列NC_021491.1 等的同源性高達(dá)99%，但在系統(tǒng)發(fā)育樹中SA4 與惡臭假單胞菌( Pseudomonas putida)、黃褐假單胞菌( Pseudomonas fulva) 和蒙氏假單胞菌( Pseudomonas monteilii) 等菌都不能聚在一起(圖5)，表明菌株SA4 可能是假單胞菌屬中的其它種。

圖4 菌株SA4 基因組DNA 及PCR 產(chǎn)物凝膠電泳

圖5 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

許多PGPR 都可以產(chǎn)生生長素IAA，它可以促進(jìn)植物根系的生長發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)植物有效地吸收土壤中的營養(yǎng)。本試驗從芝麻根際分離篩選出7株產(chǎn)IAA 的菌株，其中菌株SA4 產(chǎn)生長素的能力最強(qiáng)，它對黃瓜種子和玉米種子具有明顯的促生作用，黃瓜種子在經(jīng)過菌株SA4 處理80 h 后，主根的長度約是對照組的3 倍，總根重約是對照組的2倍;玉米種子在經(jīng)過菌株SA4 處理7 d 后，主根的長度約是對照組的3 倍，總根重也約是對照組的3倍。菌株SA4 革蘭染色呈陰性桿狀，經(jīng)分子鑒定屬于假單胞菌屬。假單胞菌的促生作用也有類似的報道。劉曉東等研究發(fā)現(xiàn)從玉米根際篩選的假單胞菌KM2、KM19 菌株對玉米具有明顯的促生作用[11]，與本文結(jié)果相似。Glick 等研究發(fā)現(xiàn): 產(chǎn)低水平IAA 的惡臭假單胞菌( Pseudomonas putida)GR12-2 可使油菜幼苗初生根伸長增加20% ～30%，而產(chǎn)高水平IAA 的PGPR 卻可以導(dǎo)致油菜幼苗大量次生根的發(fā)育[18]。劉佳莉等研究發(fā)現(xiàn)具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸( ACC) 脫氫酶活性的假單胞菌A-4 可以有效增加燕麥的株高、鮮重、根長、根重，并可以提高燕麥的鹽堿抗性[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，芝麻根際微生物中存在促生菌，豐富了重要微生物資源庫。進(jìn)一步將通過生理生化試驗鑒定菌株SA4，并深入研究溫度、pH 等不同因素對SA4 分泌生長素的影響，明確該菌株產(chǎn)生長素的最佳條件，為該菌株在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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