戴 一,曹殿潔,夏蓮鳳

(安徽新華學院藥學院,安徽合肥 230088)

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二子菊花飲抗氧化活性研究及其木犀草素和槲皮素含量測定

戴 一,曹殿潔,夏蓮鳳

(安徽新華學院藥學院,安徽合肥 230088)

二子菊花飲,高效液相色譜,木犀草素,槲皮素,抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

女貞子 購自于亳州藥材市場,枸杞子、菊花為貢菊 藥圣堂制藥有限公司;DPPH天津西瑪科技有限公司,批號:132805;槲皮素對照品 天津一方科技有限公司;木犀草素對照品 天津一方科技有限公司;甲醇為色譜純,乙醇、三氟乙酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純。

安捷倫1260高效液相色譜儀 安捷倫1260 MWD檢測器,安捷倫1260二元泵 美國安捷倫科技公司;UV-4802S型紫外可見分光光度儀 尤尼柯(上海)儀器有限公司;梅特勒-托利多AB135-S電子分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司;FA2004型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;Eppendorf Research 移液器 德國Eppendorf 股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 二子菊花飲干膏的制備 取女貞子、枸杞子各15g,菊花10g,加10倍量水,于圓底燒瓶中100℃回流提取1.5h,抽濾,煎煮3次,濾液合并、濃縮至干,真空40℃干燥48h,稱重計算得膏率后備用[8]。

1.2.2 二子菊花飲抗氧化活性實驗 精密稱取二子菊花飲水提取物配制成200、100、50、25、12.5、6.25mg/mL水溶液,采用DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法來進行抗氧化實驗,采用origin8.0以樣品的濃度與其對應的自由基清除率繪制曲線,擬合樣品濃度與清除率之間關系的曲線方程,計算EC50[9-10]。

1.2.2.1DPPH·的清除實驗 精確稱取5mgDPPH,用甲醇溶解并定容于100mL量瓶中,配制成0.05mg·mL-1的DPPH·溶液,于0～4℃避光保存,備用,將樣品原液精確地配制成系列濃度的溶液。分別取樣品溶液3.5mL(0.1mL樣液+3.4mL水)與DPPH溶液2.5mL均勻混合,于黑暗中放置30min,在517nm處測定其吸光度值Ai,同時測定3.5mL水加2.5mLDPPH·溶液的吸光度A0,樣品溶液3.5(0.1mL樣液+3.4mL水)mL樣品溶液加2.5mL甲醇的吸光度Aj,以2.5mL甲醇加3.5mL水做空白對照進行測定。根據(jù)DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100,計算DPPH·的清除率。

1.2.2.2 ·OH的清除實驗 在試管中加入不同濃度的樣品溶液0.1mL,6mol/mL水楊酸-乙醇0.5mL,6mmol·L-1FeSO4溶液0.5mL,最后加入0.5mL0.1%H2O2,總體積5mL,以雙蒸水補足體積。其中對照管不加樣液,樣底管不加H2O2,搖勻后啟動反應,37℃水浴反應30min,以蒸餾水作參比,在510nm下測定各樣品溶液的吸光度，計算·OH的清除率。

A樣品為加入二子菊花飲水提物溶液后的羥自由基體系的吸光度值;A對照為不加二子菊花飲水提物溶液的羥自由基體系的吸光度值;A樣底為羥自由基體系中不加H2O2而加二子菊花飲水提物溶液的吸光度值。

1.2.3 二子菊花飲中木犀草素和槲皮素的含量測定

1.2.3.1HPLC分析條件 色譜柱:AgilentHC-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-0.2%三氟乙酸(53∶47,V/V);流速1.0mL/min,檢測波長350nm;柱溫25℃[11];進樣量20μL。

1.2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素和槲皮素8.57mg和8.05mg置于100mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,并從中取1mL定容至10mL,制成木犀草素和槲皮素濃度分別為0.00857和0.00805mg/mL的混合對照品溶液。

1.2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取二子菊花飲水提取物0.5g,以甲醇定容至25mL容量瓶中,進樣前用0.45μm微孔濾膜濾過。

1.2.3.4 線性關系考查 精密吸取木犀草素和槲皮素混合對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL加甲醇定容至10mL,搖勻,吸取混合對照品溶液20μL進樣分析,以濃度(C)對峰面積(A)繪制標準曲線。

1.2.3.5 精密度實驗 取同一質(zhì)量濃度的木犀草素和槲皮素混合對照品溶液,重復進樣6次,測定峰面積,計算峰面積的RSD。

1.2.3.6 重復性實驗 按二子菊花飲組方藥材比例精密稱取該方2g,共6份,按1.2.3.3項下方法制備供試品溶液后按1.2.3.1項下條件進行測定,計算木犀草素和槲皮素含量的RSD。

1.2.3.7 穩(wěn)定性實驗 同一供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10h后進樣分析,計算木犀草素和槲皮素峰面積的RSD。

1.2.3.8 回收率實驗 精密稱取9份已測定木犀草素和槲皮素含量的藥材2.0g,按二子菊花飲所含兩黃酮量的80%、100%和120%比分別加入對照品,每個加樣比做3次實驗,提取物浸膏減半稱取制成供試品溶液后進行分析,計算木犀草素、槲皮素的平均回收率。

1.2.3.9 樣品含量測定 精密稱取二子菊花飲提取物0.5g,各稱取3份,按1.2.3.3項下方法制成供試品溶液,按1.2.3.1項下色譜條件下分析,測定峰面積,計算二子菊花飲中木犀草素及槲皮素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 二子菊花飲干膏的得率

通過平行3次實驗對二子菊花飲方進行提取研究,得膏率平均為47.21%,具體結(jié)果見表1。

表1 二子菊花飲提取得膏率Table 1 Yield of the total extract from Erzi Juhua Yin

2.2 二子菊花飲抗氧化活性實驗

2.2.1 DPPH·的清除實驗 通過對6個不同濃度的二子菊花飲提取溶液進行DPPH·的清除實驗,發(fā)現(xiàn)二子菊花飲提取物在6.25～200mg/mL濃度范圍內(nèi)具有較好的清除率,經(jīng)線性擬合,二子菊花飲提取物濃度(x)與清除率(y)的方程式為:y=0.2334x+38.992(r=0.9978),表明線性關系良好,EC50為47.16mg/mL。

圖1 不同濃度二子菊花飲提取物對DPPH·清除作用Fig.1 Scavenging activity of different concentrations of Erzi Juhua Yin extraction on DPPH·

2.2.2 ·OH 的清除實驗 通過對6個不同濃度的二子菊花飲提取溶液進行·OH的清除實驗,發(fā)現(xiàn)二子菊花飲提取物在6.25～200mg/mL范圍內(nèi)清除率逐步增加,尤其是在6.25～50mg/mL濃度范圍內(nèi)清除率增加顯著，而100mg/mL及200mg/mL清除率增加緩慢,EC50為12.37mg/mL。

圖2 不同濃度二子菊花飲提取物對·OH 清除作用Fig.2 Scavenging activity of different concentrations of Erzi Juhua Yin extraction on ·OH

圖3 不同濃度二子菊花飲提取物對·清除作用Fig.3 Scavenging activity of different concentrations of Erzi Juhua Yin extraction on ·

2.3 二子菊花飲中木犀草素和槲皮素含量測定

2.3.1 標準曲線的繪制 對5個不同濃度點的木犀草素和槲皮素混合對照品溶液進樣分析后,以濃度(C)對峰面積(A)繪制標準曲線,得木犀草素和槲皮素回歸方程分別為A=54119C+8.06,r=0.9992;A=42609C+2.14,r=0.9998,二者分別在0.171～0.857μg/mL和0.161～0.805μg/mL濃度范圍呈良好的線性關系。

圖4 木犀草素和槲皮素混合對照品HPLC色譜圖 Fig.4 HPLC chromatograms of standard 注:1:槲皮素;2:木犀草素,圖5同。

2.3.2 精密度實驗、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性實驗 同一質(zhì)量濃度的木犀草素和槲皮素混合對照品溶液進樣6次分析后,木犀草素和槲皮素峰面積RSD分別為1.42%和1.29%,表明精密度良好,見表2。對6份制備的二子菊花飲供試液測定后,木犀草素和槲皮素含量的RSD 值分別為1.35%和1.41%,表明具有較好重現(xiàn)性,見表3。對于0、2、4、6、8、10h后進樣分析的同一供試液,木犀草素和槲皮素峰面積的RSD分別為0.81%和0.77%,表明供試品溶液在10h 內(nèi)穩(wěn)定,見表4。

2.3.3 回收率實驗 9份藥材經(jīng)加樣制備供試液進行HPLC分析,其結(jié)果見表5、表6。木犀草素和槲皮素的回收率分別在95.75%～98.55%和95.22%～99.67%之間,RSD值均小于1.5%。

表2 精密度實驗Table 2 Precision experiments

表3 重復性實驗Table 3 Pepeatability experiments

表4 穩(wěn)定性實驗Table 4 Stability experiments

表5 木犀草素回收率實驗Table 5 Method recevery of luteolin

2.3.4 二子菊花飲中木犀草素和槲皮素含量 對3份二子菊花飲提取物進行HPLC分析,供試液色譜圖為圖5,結(jié)果見表7,表明二子菊花飲中含有較豐富的木犀草素和槲皮素。

表6 槲皮素回收率實驗Table 6 Method recevery of quercetin

表7 二子菊花飲中木犀草素和槲皮素的含量Table 7 Contents of luteolin and quercetin in Erzi Juhua Yin

圖5 二子菊花飲提取物HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of Erzi Juhua Yin extraction

3 結(jié)論

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Study on the antioxidant activities of Erzi Juhua Yinand the contents of luteolin and quercetin

DAI Yi,CAO Dian-jie,XIA Lian-feng

(School of Pharmaceutical Sciences of Anhui Xinhua University,Hefei 230088,China)

Erzi Juhua Yin;HPLC;luteolin;quercetin;antioxidant activities

2014-05-04

戴一(1979-)，男，碩士，講師，研究方向：活性天然產(chǎn)物研究。

安徽省教育廳自然科學研究項目(KJ2012Z136); 國家級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃創(chuàng)新訓練項目(201312216023)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0282-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.051