唐燕文,何衛(wèi)華,廖霞俐,*,楊 波,*

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南省輕工業(yè)學(xué)校,云南昆明 650216)

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瑪咖有效成分多種提取方法的比較研究

唐燕文1,2,何衛(wèi)華1,廖霞俐1,*,楊 波1,*

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南省輕工業(yè)學(xué)校,云南昆明 650216)

本文分別采用乙醇回流提取、乙醇常溫振搖提取、乙醇-水聯(lián)合提取、超臨界提取、超聲波提取等不同方法對瑪咖有效成分進行了提取研究。結(jié)果表明,依次用95%乙醇、50%乙醇和蒸餾水對瑪咖進行回流提取能夠獲得較高的得率(4.4%)。同時,利用紅外光譜和紫外光譜等分析方法對該提取物進行了初步表征,其結(jié)果與文獻報道瑪咖中含有瑪咖烯、瑪卡酰胺等有效成分相符合。

瑪咖,有效成分,提取方法,表征

瑪咖(LepidiummeyeniiWalp.,maca)是十字花科植物,原產(chǎn)于秘魯中部4000米以上的安第斯山區(qū),具有形似蘿卜樣的塊根?，斂I養(yǎng)豐富,富含蛋白質(zhì)、糖類、脂肪酸、氨基酸以及獨有的瑪咖烯、瑪咖酰胺等[1-3],有消除疲勞、增強精力、改善性功能、提高生育能力以及抗氧化等作用[4-6]。

近年來,在我國的云南和新疆等地開始大面積地種植瑪咖,而如何更好地對其進行有效利用和深入開發(fā)已成為亟待解決的重要課題[7]?，F(xiàn)有的對瑪咖成分的報道中,主要集中在瑪咖揮發(fā)油[8]、多糖[9-11]和總生物堿[12-13]的研究,但對瑪咖的總有效成分的提取和表征尚未有研究報道。考慮到對瑪咖多種營養(yǎng)成分的綜合利用及盡可能的防止其有效成分的流失,本文希望對瑪咖總有效成分提取的工藝條件進行探討,為瑪咖在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣提供必要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑪咖 2012年采摘自麗江瑪咖種植區(qū)。取瑪咖塊根切片,曬干,粉碎機粉碎成細粉備用;乙醇、乙醚、石油醚等試劑均為化學(xué)純,其水溶液濃度均為體積濃度;蒸餾水;CO2氣體為食品級,質(zhì)量分數(shù)99.9%,昆明梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司。

HA221-50-06超臨界萃取儀 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司;SPD-15C高效液相色譜 日本島津公司;BS124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng);85-2磁力攪拌器 江蘇國華儀器有限公司;BPZ-6033真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE-52AA減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 北京萊伯泰科儀器有限公司;SK5210超聲儀 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇回流提取 稱取瑪咖干粉25g,分別用400mL濃度30%、60%、90%、95%、100%乙醇溶液分兩次提取(每次200mL),每次2h。提取完畢過濾,減壓蒸去溶劑,得棕色浸膏;真空干燥后得到棕色粉狀提取物[14]。通過直接稱重獲得提取物的質(zhì)量,并由此計算瑪咖有效成分的提取得率,如下面公式所示(下同),且一般通過比較得率大小和提取物性狀來對各提取方法進行比較。

1.2.2 乙醇常溫振搖提取 稱取瑪咖干粉25g,用400mL一定濃度的乙醇溶液在一定溫度下振搖24h,提取兩次(每次200mL),抽濾,濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮得到棕色浸膏,真空干燥得到棕色粉狀提取物[15]。選取溫度(A)、乙醇濃度(B)和料液比(C)三個因素,設(shè)定提取時間為24h,選定提取溫度(℃)、乙醇濃度(%,體積濃度)和料液比(w/v)等三個條件為主要因素,通過三因素三水平正交表L9(34)正交實驗設(shè)計方案對乙醇常溫振搖提取效果進行了研究。其中,提取溫度取20、30和40℃,乙醇濃度取30%、60%和90%,料液比取1∶8、1∶10和1∶12,正交實驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 乙醇常溫提取的正交實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Orthogonal design of ethanol extraction at moderate temperature

按照正交實驗設(shè)計在不同的條件下用400mL乙醇溶液(分兩次,每次200mL)振搖24h,抽濾,濾液減壓濃縮得到棕色浸膏,真空干燥得到棕色粉狀提取物。

1.2.3 乙醇-水聯(lián)合回流提取 稱取瑪咖干粉25g,選取95%乙醇、50%乙醇和蒸餾水進行聯(lián)合回流提取(每次1.5h,固液比w/v=1/8),提取完過濾,將三次的濾液合并,減壓濃縮得浸膏,再真空干燥得到棕色干粉[16]。變換三種溶劑的提取順序,得到不同的瑪咖提取得率。

1.2.4 不同溶劑回流提取 稱取瑪咖干粉25g,分別用400mL的石油醚、乙醚、95%乙醇溶液分兩次提取(每次200mL),每次2h。提取完畢后過濾,減壓回收溶劑,得浸膏,真空干燥后得到棕色干粉。

1.2.5 超臨界提取 取瑪咖干粉100g,采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)萃取,用95%的乙醇作夾帶劑,在一定的萃取壓力和萃取溫度下,萃取一定時間[17]。重復(fù)萃取一次,將兩次的萃取液合并,減壓濃縮并真空干燥后得到棕色粉狀提取物。選取萃取壓力(A)、萃取溫度(B)和萃取時間(C)為三個因素,對其進行了正交實驗研究。設(shè)定二氧化碳流量為3L/min,選定萃取壓力(A,MPa)、萃取溫度(B,℃)、萃取時間(C,h)和夾帶劑用量(D,mL)等四個影響瑪咖得率的主要因素,通過四因素三水平正交表L9(34)正交實驗設(shè)計測定不同組合的萃取結(jié)果,以尋找較佳的提取條件。其中,萃取壓力分別取25、30和35MPa,萃取溫度分別取35、40和45℃,萃取時間分別取2、3和4h,夾帶劑用量分別取100、200和300mL。正交實驗設(shè)計的因素水平見表2。

表2 超臨界二氧化碳萃取的正交實驗設(shè)計因素水平表Table 2 Orthogonal design of supercritical carbon dioxide extraction

按照正交實驗設(shè)計超臨界二氧化碳萃取瑪咖干粉100g,將得到的萃取液過濾,濾液減壓濃縮得到棕色浸膏,真空干燥得到棕色粉狀提取物。

1.2.6 超聲波提取 取瑪咖粉末25g于500mL三角燒瓶中,分別加入200mL濃度30%、60%、90%、95%、100%的乙醇溶液,置于功率為200W的超聲波清洗器中,溫度50℃下超聲提取20min,提取液3000r/min離心5min[18]。取沉淀用200mL對應(yīng)濃度的乙醇溶液重復(fù)提取1次,提取液3000r/min離心5min。合并上清液,減壓濃縮得浸膏,真空干燥得到棕色干粉。

1.2.7 瑪咖有效成分的表征 紅外光譜(IR)分析:采用溴化鉀壓片法;紫外可見光光譜(UV-vis)分析:波長190～900nm。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 本文采用Origin 6.0專業(yè)版進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇回流提取

如圖1所示,在固液比相同的條件下,隨著乙醇濃度的增高,瑪咖的得率逐漸增大。當乙醇濃度為95%時,瑪咖的得率最高(3.8%)。當乙醇濃度繼續(xù)升高時,得率降低。

圖1 乙醇回流提取時乙醇濃度對瑪咖得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction yield of maca by refluxing

2.2 乙醇常溫振搖提取

表5 乙醇-水聯(lián)合回流提取的實驗結(jié)果Table 5 Results from ethanol-water combined extraction

表6 回流提取時不同的溶劑對瑪咖得率的影響Table 6 Effects of solvents on the extraction yield of maca

按照正交設(shè)計條件乙醇常溫振搖提取瑪咖干粉的實驗結(jié)果如表3所示。

表3 乙醇常溫提取的正交實驗結(jié)果Table 3 Results of L9(34)orthogonal experiment of ethanol extraction at moderate temperature

由表3中對各因素(溫度A、乙醇濃度B、料液比C)的極差分析結(jié)果可知:因素B的極差最大,極差值為2.6,因素A的極差次之,極差值為0.6,因素C的極差最小,極差值為0.3。在各因素中,因素B即乙醇的濃度對瑪咖得率的影響最為顯著,其次是因素A即提取溫度對瑪咖得率的影響較小,因素C即料液比對瑪咖得率的影響很小,各因素極差R值的大小順序為:RB>RA>RC,即影響乙醇常溫振搖提取瑪咖有效成分得率的實驗因素的主次順序是:乙醇濃度>浸漬溫度>料液比。在乙醇常溫振搖提取瑪咖的正交實驗結(jié)果中,因素A以第2水平為最好,因素 B以第2水平最好,因素C以第1水平最好,由于得率是越高越好,在不考慮交互作用的情況下,優(yōu)化方案應(yīng)取各因素最大K值所對應(yīng)的水平,即為A2B2C1,即浸漬溫度為25℃,乙醇濃度為60%,料液比為1∶8。因為此最優(yōu)組合方案不在正交實驗組合內(nèi),所以進行了驗證性實驗(重復(fù)三次取平均值),實驗結(jié)果如表4所示。

表4 乙醇常溫提取的驗證實驗Table 4 Verification test of ethanol extraction at moderate temperature

由表4的驗證實驗結(jié)果表明:在乙醇常溫振搖提取溫度25℃,乙醇濃度60%,料液比(w/v)為1∶8的工藝條件下瑪咖浸膏的平均得率為3.8%,高于之前正交實驗方案中的最高得率(3.6%),也驗證了正交實驗法的有效性。

2.3 乙醇-水聯(lián)合回流提取

通過變換95%乙醇、50%乙醇和蒸餾水的提取順序,獲得的乙醇-水聯(lián)合回流提取的實驗結(jié)果如表5所示。

從實驗結(jié)果得出:依次用200mL 95%乙醇、50%乙醇和蒸餾水對瑪咖進行回流提取,所得瑪咖提取得率最高,達4.4%。

2.4 不同溶劑回流提取

對石油醚、乙醚和乙醇(95%)三種有機溶劑的提取效果進行了對比(表6)。石油醚的提取得率最高(4.4%),其提取物呈棕黑色,性狀不同于其它溶劑的提取物。而乙醚的得率(2.7%)低于95%乙醇(3.8%)。

2.5 超臨界提取

使用正交實驗設(shè)計超臨界二氧化碳提取瑪咖有效成分的實驗結(jié)果如表7所示。

從超臨界二氧化碳提取的正交實驗結(jié)果和極差分析可知:因素A以第2水平為最好,因素 B以第3水平為最好,因素C以第3水平為最好,因素D以第2水平為最好。在不考慮交互作用的情況下,優(yōu)化方案應(yīng)取各因素最大K值所對應(yīng)的水平,即為A2B3C3D2,即最優(yōu)提取方案為:萃取壓力30MPa,萃取溫度45℃,萃取時間4h,夾帶劑用量200mL。因為此組合不在正交實驗組合內(nèi),所以通過驗證性實驗進行檢驗(重復(fù)三次取平均值),實驗結(jié)果如表8所示。

表7 超臨界提取的正交實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 7 The results and analysis of L9(34)orthogonal experiment of supercritical extraction

表8 超臨界提取的驗證實驗Table 8 Verification test of supercritical extraxtion

表9 不同提取方法提取結(jié)果比較Table 9 Comparison of different extraction methods

實驗結(jié)果表明:在萃取壓力為30MPa,萃取溫度45℃,萃取時間4h,夾帶劑用量為200mL的工藝條件下瑪咖浸膏的得率為3.3%,高于之前正交設(shè)計實驗的最高得率(3.2%),驗證了正交實驗的有效性。

2.6 超聲波提取

如圖2所示,乙醇濃度在90%和95%時得率較高(均為3.2%),低濃度的乙醇得率較低。

圖2 超聲波提取時乙醇濃度對瑪咖得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of maca under ultrasonic irradiation

2.7 多種提取方法的結(jié)果比較

歸納上述的實驗結(jié)果,用相同濃度的乙醇運用不同的方法提取瑪咖有效成分的結(jié)果如表9所示。

由表9可以得出:用乙醇-水(依次用95%乙醇、50%乙醇和蒸餾水)聯(lián)合回流提取瑪咖的得率最高,達4.4%;用乙醇回流提取和常溫振搖提取兩種方法的得率相同,均為3.8%;超臨界二氧化碳提取和超聲波提取的得率較低,分別為3.3%和3.2%。用石油醚提取雖然也能獲得較高得率(4.4%),但由于其僅能獲得瑪咖的脂溶性成分,而對水溶性成分如多糖等的提取能力較差,不能較全面地獲得其有效成分,故不將其作為較佳提取方法。當采用乙醇和水聯(lián)合提取時,可以較全面地提取瑪咖中的脂溶性和水溶性成分,即可以最大限度地獲得瑪咖的各種營養(yǎng)及活性成分,所以不失為一種較佳的有效提取方法。

2.8 瑪咖有效成分的表征結(jié)果

2.8.1 紅外光譜(IR)分析結(jié)果 瑪咖提取物的紅外光譜如圖3所示。由圖中可知:瑪咖提取物在3390.3cm-1處的強寬吸收峰為O-H伸縮振動峰存在分子間和分子內(nèi)的氫鍵,在3700～3000cm-1出現(xiàn)的寬峰還可能包括N-H伸縮振動;2923.2cm-1是亞甲基的C-H伸縮振動峰;2851.9cm-1是-CH3、-CH2、-CH、-CHO的伸縮振動峰;2047.6cm-1是的伸縮振動峰;1613.0cm-1是C=O的伸縮振動峰;1379.5cm-1是COO-的伸縮振動峰;1074.6cm-1是C-O-C的伸縮振動峰;905.9cm-1是C=C的伸縮振動峰;900～500cm-1區(qū)域的譜帶多而且弱,應(yīng)該為形成氫鍵的O-H面外彎曲、芳環(huán)上C-OH鍵面內(nèi)彎曲振動、-C-C的伸縮振動峰,準確指認有困難。此外,該物質(zhì)在1400～1100cm-1處有較強吸收,而此處為芳香族的C-N伸縮振動峰。由上述的分析可以得出:該瑪咖提取物的成分中含有較多-OH基團以及具有-CH3、-CH2、-CH、-CHO、C-O-C、C=C、COO-等官能團的分子,這與其中包含了瑪咖烯、瑪咖酰胺、異硫氰酸酯、芥子油苷、植物固醇、黃烷醇、多糖等多種有效成分的文獻報道相符合[1-3]。

圖3 瑪咖提取物的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of maca extracts

2.8.2 紫外可見光光譜分析(UV-vis)結(jié)果 瑪咖提取物的紫外可見吸收光譜顯示:各組成物質(zhì)的最大吸收峰出現(xiàn)在200～300nm處,而在300～400nm處有弱吸收峰。通常認為,含有苯環(huán)的物質(zhì)一般在270nm有最大吸收,因此可以確定該粗提物中含有苯環(huán),結(jié)合紅外光譜能夠確定有帶苯環(huán)的物質(zhì)存在,而且該物質(zhì)存在共軛體系,這同樣與瑪咖中的重要有效成分如瑪咖烯、瑪卡酰胺和黃烷醇等分子的結(jié)構(gòu)特征相符合[1-3]。

3 結(jié)論

通過選用不同濃度的乙醇、不同的溶劑對瑪咖進行回流提取、采用不同的提取方法包括:乙醇回流提取、乙醇室溫振搖提取、不同有機溶劑提取、超臨界萃取提取及超聲波提取等方法對干瑪咖進行提取,最終發(fā)現(xiàn)采用乙醇-水聯(lián)合回流提取的方法能夠獲得較高的得率(4.4%),可為進一步開發(fā)瑪咖的有效成分提供工藝路線和理論基礎(chǔ)。通過對提取物進行初步的成分分析,可印證其應(yīng)含有之前文獻報道對人體具有重要作用的成分如瑪卡烯、瑪咖酰胺等成分。

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Comparison of extraction methods of active ingredients of maca

TANG Yan-wen1,2,HE Wei-hua1,LIAO Xia-li1,*,YANG Bo1,*

(1.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Yunnan Light Industry School,Kunming 650216,China)

Active ingredients of maca were extracted using several methods such as refluxing with ethanol,agitation with ethanol at moderate temperature,refluxing with ethanol-water,supercritical fluid extraction and ultrasonic extraction. The better extraction yield of maca(4.4%)was provided by refluxing with ethanol(95%),ethanol(50%)and water consecutively. Moreover,the extracts were preliminarily characterized with IR and UV-vis spectra,which showed well consistency with the previously reported main bioactive compounds such as macaene,macamide,et al.

maca;active ingredients;extraction method;characterization

2014-05-04

唐燕文(1966-)，女，在職碩士研究生，高級講師，研究方向：天然產(chǎn)物制品的工藝研究。

*通訊作者:廖霞俐(1981-)，男，博士，講師，研究方向：藥物化學(xué)。 楊波(1969-)，男，博士，教授，研究方向：超分子化學(xué)。

國家自然科學(xué)基金項目(21362016)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2011FZ059)；云南省教育廳項目(2012Y533)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)05-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.031