劉春燕,戴明福,夏 姣,徐 林,沈麗雯,蒲 彪，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014;2.浙江工業(yè)大學(xué)政治與公共管理學(xué)院，浙江杭州 310023)

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傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過程中酵母菌分離鑒定

劉春燕1,戴明福2,夏 姣1,徐 林1,沈麗雯1,蒲 彪1，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014;2.浙江工業(yè)大學(xué)政治與公共管理學(xué)院，浙江杭州 310023)

以紅皮蘿卜為原料,分別用自然發(fā)酵法、老泡菜水發(fā)酵法泡制四川泡菜,采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法、26S rDNA序列測定技術(shù),研究不同發(fā)酵時期各泡菜水中的酵母菌群分布及動態(tài)變化。研究結(jié)果表明,發(fā)酵過程中共存在5種酵母菌,經(jīng)鑒定其依次為清酒假絲酵母菌(Candidasake)、擲孢酵母(Sporisoriucamicdor)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、畢赤酵母屬galeiformis(Pichiagaleiformis)、酒酵母(Kazachstaniaexigua)。對發(fā)酵過程中動態(tài)分析表明:Pichiaspp.、Kazachstaniaspp.為傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中主要的酵母菌。此外,兩種不同發(fā)酵方式發(fā)酵過程中出現(xiàn)的酵母菌種類不同,但動態(tài)變化趨勢大致相同。

四川泡菜,酵母菌,26S rDNA,動態(tài)變化

泡菜是一種以新鮮蔬菜為原料,利用低濃度鹽水或少量食鹽進(jìn)行泡制或腌制,且以乳酸菌發(fā)酵為主[1],兼有酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等過程而制成的具有特殊風(fēng)味的微生物發(fā)酵食品。其中乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量的有機(jī)酸,酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生大量的醇類風(fēng)味成分[2],傳統(tǒng)四川泡菜味道咸酸爽口,自然清純,制作過程簡單,深受廣大消費(fèi)者喜愛。

酵母菌(Yeast)是一種在有氧和無氧環(huán)境下都能生存,屬于兼性厭氧菌,且能發(fā)酵糖類產(chǎn)能的單細(xì)胞真菌。發(fā)酵蔬菜中的酵母菌主要有異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)、德氏酵(Debaryomyces)、紅酵母(Rhodotorulaglutinis)、易酒香酵母(Brettanomycesanomalus)等十幾個種[3]。Ho-Won Chang[4]等對韓國泡菜中的Lodderomycesspp.,Trichosporonspp.,Candidaspp.,等酵母菌進(jìn)行了分離鑒定。由于泡菜原料未經(jīng)過滅菌處理,因此在后期發(fā)酵過程中一旦環(huán)境溫度升高或者存放條件不利,泡菜中的腐敗微生物就會大量滋生,這樣在泡菜泡漬過程中容易出現(xiàn)“生化”等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象,影響泡菜品質(zhì)。敖曉琳等[5]對引起泡菜“生化”腐敗的微生物進(jìn)行了分離鑒定,得到2株真菌P.manshurica。張鵬[6]從3種優(yōu)質(zhì)四川泡菜里分離鑒定出Candidavalida和Candidaparapsilosis。本實(shí)驗(yàn)對傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過程中存在的酵母菌進(jìn)行分離鑒定,旨在分析泡菜發(fā)酵過程的酵母菌菌群及動態(tài)變化,為進(jìn)一步研究泡菜中酵母菌對泡菜產(chǎn)品品質(zhì)的影響機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

表1 菌落形態(tài)特征及個體特征Table 1 Colony morphology and microscopy morphology

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅皮蘿卜 雅安市售;老泡菜水 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

2×PCR Master Mix、Fungal DNA Kit真菌DNA提取試劑盒(D3390-01) 美國Omega Bio-Tek有限公司;所用其他生化試劑均為分析純。

玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基[7],為了在篩選過程中排除細(xì)菌的干擾,在培養(yǎng)基中加 100mg/L 的氯霉素。

SW-CJ-IF單人雙面超凈工作臺 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;Powerpac Basic 電泳儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)、MycyclerTMThermal Cycler PCR儀 美國BIO-RAD公司;CX21S1電子顯微鏡 日本OLYMPUS公司;YXQ.SG41.280高壓蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 泡菜汁中酵母菌的分離篩選 取不同發(fā)酵時期的泡菜液作梯度稀釋后,分別涂布于PDA、YPD、孟加拉紅固體培養(yǎng)基,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5d后,根據(jù)在不同培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)進(jìn)行初步分類,挑取形態(tài)不同的單菌落再于YPD培養(yǎng)基上劃線,純化2次,觀察菌落形態(tài),確定為單菌落后將所分離的酵母菌轉(zhuǎn)接于試管斜面,于4℃冰箱保存[8]。

1.2.2 菌株的生理生化鑒定 生化鑒定方法參照《真菌鑒定手冊》[9]及《酵母菌的特征與鑒定手冊》[10],根據(jù)菌株的培養(yǎng)形態(tài)特征及生理生化特性初步確定其分類地位。

1.2.3 菌株的分子學(xué)鑒定 用試劑盒提取菌株的總DNA,以NL1、NL4為引物對菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析。其引物序列:正向引物NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′;反向引物NL4:5′-GGTCCG TGTTTCAAGACGG-3′[11-12]。

PCR擴(kuò)增體系:2 × PCR Master Mix 12.5μL、引物各1μL、模板DNA 1μL、ddH2O補(bǔ)至25μL。

PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共36個循環(huán);最后72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn),目的片段長度在600bp左右。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因測序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將菌株的26S rRNA基因序列提交到GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫并與數(shù)據(jù)庫中已知的相關(guān)序列進(jìn)行比較,將相似度高的序列與測定序列通過Clustalx 進(jìn)行多重序列比對,比對結(jié)果用MEGA軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.2.5 酵母菌種類動態(tài)分析 分別取自然發(fā)酵、老泡菜水發(fā)酵1、2、3、4、5、6、7、8、9d的紅皮蘿卜泡菜水進(jìn)行酵母菌的動態(tài)分析。取合適稀釋度的泡菜水涂布于YPD平板上,于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～5d后觀察菌落形態(tài),并對菌落形態(tài)進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

對挑取的 124個酵母菌株進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定,最終歸納出5株形態(tài)不同的酵母菌,將其分別編號為:Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5。上述各菌株的菌落及細(xì)胞主要形態(tài)特征如表1所示,照片見圖1。

圖1 菌落形態(tài)特征及個體特征(100×)Fig.1 Colony morphology and microscopy morphology(100×)

在形態(tài)學(xué)分類的基礎(chǔ)上,對以上5株酵母菌進(jìn)行初步的生理生化特性實(shí)驗(yàn),如表2所示。

對實(shí)驗(yàn)菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特性進(jìn)行分析,Y-2發(fā)酵葡萄糖、半乳糖時可變,不進(jìn)行尿酶發(fā)酵和產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵。Y-4不能發(fā)酵糖類及硝酸鹽類,在37℃生長時可變,根據(jù)以上的生理生化特性并不能將其準(zhǔn)確的鑒定出來。

2.2 26S rDNA鑒定

提取的實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA用1%瓊脂糖電泳檢測,得到了一條明顯的亮帶,說明所采用提取DNA的方法準(zhǔn)確有效。將所得DNA作為模板進(jìn)行26S rDNA PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物中有600bp目的條帶,且清晰可見,無雜帶,可用于菌株26S rDNA測序。供試菌基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖2。

表2 菌株生理生化特性Table 2 Physico-chemical characteristics

注:+表示陽性;-表示陰性;V表示可變反應(yīng)。

表3 酵母菌的動態(tài)變化Table 3 Dynamic change of Yeast

圖2 26S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Elctrophoresis of amplification products of 26S rDNA

測序結(jié)果在NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫通過BLAST進(jìn)行序列比對,將同源性較高的典型菌株的序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖3。

圖3 26S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree derived from 26S rDNA sequences

由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看,實(shí)驗(yàn)分離的菌株均屬于酵母菌屬,其中Y-1與Candidasake(JX880410.1)和Candidasake(KF912818.1)及Pichiagaleiformis(JX880398.1)聚在一起,因此Y-1可能為清酒假絲酵母或畢赤酵母屬,結(jié)合Y-1的生理生化特性將其鑒定為清酒假絲酵母。Y-2與Pichiamanshurica(JQ419830.1)和Pichiagaleiformis(JX880398.1)聚在一起,且它們的同源關(guān)系的可信度達(dá)到99%以上,因而Y-2被鑒定為畢赤酵母屬。Y-3與Sporobolomycescarnicolor(AY070008.1)聚在一起,被鑒定為擲孢酵母屬。Y-4與Rhodotorulamucilaginosa(KC160605.1)聚在一起,為膠紅酵母屬。而Y-5與Kazachstaniaexigua(KF241562.1)和Kazachstaniaexigua(EU020099.1)聚在一起,同源關(guān)系的可信度達(dá)到99%以上,其為酒酵母屬。

分離菌株Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5的26S rDNA序列已注冊到NCBI數(shù)據(jù)庫,其登錄號依次為KJ999789、KJ999790、KJ999793、KJ999791、KJ999792。

2.3 不同泡菜中酵母菌的動態(tài)變化

對不同發(fā)酵方式(自然發(fā)酵、老泡菜水發(fā)酵)泡菜泡制過程中酵母菌種類及動態(tài)變化進(jìn)行記錄:Y-1(Candida.spp.)、Y-3(Sporobolomyces.spp.)是老泡菜水發(fā)酵泡蘿卜中特有的酵母菌,在自然發(fā)酵泡蘿卜中未檢測到;而Y-2,Y-4,Y-5為兩種泡菜共有;且自然發(fā)酵泡蘿卜在發(fā)酵第3d泡菜水中的酵母菌逐漸消失,第4d Y-2、Y-5又出現(xiàn);發(fā)酵第5d后自然發(fā)酵泡菜中只檢測到Y(jié)-5,老泡菜水發(fā)酵中只有Y-2。此外,兩種不同發(fā)酵方式發(fā)酵過程中出現(xiàn)的酵母菌種類不同,但動態(tài)變化大致相同,這是因?yàn)樽匀话l(fā)酵泡菜中微生物主要來自蔬菜原料表面,而老泡菜水發(fā)酵泡菜中的微生物除附著在蔬菜本身的微生物外,還有老泡菜水所特有的穩(wěn)定的微生物體系。

2.3.1 泡菜中酵母菌的種類分析 對于泡菜中微生物的研究,主要集中在對發(fā)酵起主要作用的乳酸菌區(qū)系[14],酵母菌的研究相對較少,而對傳統(tǒng)發(fā)酵過程中酵母菌的研究還未見報道。本實(shí)驗(yàn)首次對傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中酵母菌的動態(tài)變化進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)從兩種不同發(fā)酵方式泡制泡菜發(fā)酵過程中分離到五種酵母菌,分別是清酒假絲酵母菌(Candidasake)、畢赤酵母屬galeiformis(Pichiagaleiformis)、擲孢酵母(Sporisoriucamicdor)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、酒酵母(Kazachstaniaexigua)。張?zhí)m威等[15]、賀稚非等[16]分別從腌漬蔬菜和發(fā)酵蔬菜低溫貯藏過程中分到了Candidaparapsilosis,關(guān)于從泡菜中分離到Candidasake未見報道。Pichiagaleiformis、Kazachstaniaexigua是泡菜中主要的酵母菌,這與Ho-Won Chang[4]、敖曉琳[5]、曾駿[17]等的研究結(jié)果一致。而從泡菜中分離出Sporisoriuspp.、Rhodotorulaspp.未見報道,可能是由于它們不是泡菜中的主要酵母菌,其出現(xiàn)的時間較短所致。

2.3.2 酵母菌動態(tài)分析 實(shí)驗(yàn)分離所得的五株菌在泡菜發(fā)酵過程中進(jìn)行動態(tài)分析,泡制后立即取樣分離到Y(jié)-2、Y-3、Y-4、Y-5四株菌,24h后Y-3、Y-4迅速消失,同時在老泡菜水發(fā)酵泡菜中出現(xiàn)Y-1,且出現(xiàn)后隨即消失。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵啟動后乳酸菌為主要的發(fā)酵優(yōu)勢菌,其大量產(chǎn)生有機(jī)酸使得微生物體系整體處于酸性環(huán)境中,Y-3、Y-4耐酸性差,因而死亡消失;在老泡菜水發(fā)酵過程中Y-2始終可以檢出,這說明Y-2不是原料本身攜帶,而是來自老泡菜水,且穩(wěn)定存在于老泡菜水中;自然發(fā)酵泡蘿卜發(fā)酵第3d泡菜水中未檢測到酵母菌,第4d Y-5出現(xiàn),直至發(fā)酵結(jié)束都能檢測到Y(jié)-5。對于自然發(fā)酵過程中酵母菌消失又出現(xiàn)的原因目前還不清楚,有待于進(jìn)一步的研究。Y-5又出現(xiàn)說明其耐酸,且可能與乳酸菌之間形成穩(wěn)定的相互作用。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)從兩種不同發(fā)酵方式泡制泡菜發(fā)酵過程中分離到五種酵母菌,分別為清酒假絲酵母菌(Candidasake)、畢赤酵母屬galeiformis(Pichiagaleiformis)、擲孢酵母(Sporisoriucamicdor)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、酒酵母(Kazachstaniaexigua)。其中畢赤酵母屬galeiformis、酒酵母為傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中主要的酵母菌。此外,兩種不同發(fā)酵方式發(fā)酵過程中出現(xiàn)的酵母菌種類不同,但動態(tài)變化趨勢大致相同。

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Separation and identification of yeast during thefermentation of Sichuan pickles

LIU Chun-yan1,DAI Ming-fu2,XIA Jiao1,XU Lin1,SHEN Li-wen1,PU Biao1,*

(1.College of Food,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.School of Politics and Public Administration,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310023,China)

A red radish as materials by spontaneous fermentation,old brine fermentation making Sichuan pickle in this paper.The yeast group distribution and dynamic changes during different fermentation period by using the methods of traditional isolation and culture,26S rDNA sequencing technology were studied. The research results showed that,there were 5 kinds of yeast in the fermentation process,which identified asCandidasake,Sporisoriucamicdor,Rhodotorulamucilaginosa,PichiagaleiformsandKazachstaniaexigua. The dynamic results showed thatPichiaspp. andKazachstaniaspp. were the dominant yeast in traditional fermented pickle. In addition,though different species yeast,they had the same dynamic change in two different ways offermentation.

Sichuan pickles;yeast;26S rDNA;dynamic change

2014-04-18

劉春燕(1989-)，女，碩士研究生在讀，研究方向；果蔬加工理論與技術(shù)。

*通訊作者:蒲彪(1956-)，男，博士，教授，研究方向:果蔬加工、功能性食品。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171726)；“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目(2012BAD31B04)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012NZ0002)。

TS201.3

B

1002-0306(2015)05-0171-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.027