朱彪 趙剛 郭希民 郭紅延

口腔醫(yī)學中組織工程骨修復骨量不足的研究進展

朱彪 趙剛 郭希民 郭紅延

在口腔醫(yī)療實踐過程中，常遇到骨量不足的問題。目前，臨床應用的植骨材料包括自體骨、異體骨、異種骨和生物醫(yī)學材料等，每種植骨材料均有其特定的優(yōu)勢但又存在著各自的不足。近年來，隨著組織工程學的發(fā)展，使組織工程骨替代傳統(tǒng)植骨材料用于修復口腔頜面部的骨量不足成為可能。本文就目前在此方面的科研和臨床研究進展作一綜述。

組織工程；骨移植；口腔醫(yī)學

在進行修復頜骨、腭骨的骨缺損，填補種植體周圍骨間隙，提升過低的上頜竇底等手術(shù)時，經(jīng)常會遇到術(shù)區(qū)骨量不足的情況。它增加了手術(shù)風險，降低了手術(shù)成功率。為解決此類問題，許多人嘗試著將移植技術(shù)應用到口腔醫(yī)學領(lǐng)域，并且取得了一些進展。在眾多的移植材料中，組織工程骨有可能是最有前途的發(fā)展趨勢[1]。

組織工程學是應用工程學和生命科學的基本原理，以生物體結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系為指導，來構(gòu)建能修復、維持或者改善病損組織或器官功能生物替代物的一門新興交叉學科。傳統(tǒng)意義上的組織工程骨，包括種子細胞、生長因子和支架材料三部分。其移植策略是將機體細胞經(jīng)體外擴增獲得種子細胞，并與生物活性因子和載體材料復合，再植入到體內(nèi)的缺損部位。種子細胞在生長因子的參與下生長形成再生組織。與此同時，支架材料同步降解吸收?？谇会t(yī)學中骨組織工程研究是人體組織工程學研究的一個重要組成部分。

1 種子細胞

組織工程骨的基礎(chǔ)-種子細胞是一種干細胞，這種干細胞具有增殖和分化為不同種系細胞的潛能。按照分化階段的不同，干細胞可分為胚胎干細胞（embryonic cell，ESC）和成體干細胞（adult stem cell，ASC）兩大類。ESC又稱全能干細胞，幾乎可以分化為機體所有類型的細胞。理論上講它可以為組織工程骨提供充足的細胞來源，但是凡事有利必有弊，正是因為其具有全能性，如何使其穩(wěn)定地向成骨細胞方向分化，而又不發(fā)生變異是一個問題。另外在體外培養(yǎng)時獲得純化的ESC是有難度的。因其涉及倫理道德問題，使其臨床應用也極大地受限了。

由于ESC具有這些缺點，限制了其在科研和臨床中的應用。ASC便歷史性地成為了骨組織工程研究的主力軍。ASC主要有骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）、脂肪基質(zhì)干細胞（adpose derived stromal cell，ADSC）、臍血干細胞[2]、系列的產(chǎn)前干細胞、骨骼肌干細胞、牙髓干細胞和牙周膜干細胞等。其中BMSC因具有取材方便、容易分離、體外倍增時間短、安全穩(wěn)定、無倫理爭議等優(yōu)點，在組織工程領(lǐng)域已被廣泛應用。而且有一項骨組織工程中不同干細胞成骨能力的研究表明：人BMSC比ADSC和臍帶干細胞的堿性磷酸酶染色陽性率更高[3]。它在不同條件下可以向骨、脂肪、軟骨、骨骼肌、真皮、神經(jīng)等組織方向分化[4]。并且在一定范圍內(nèi)，ASC的接種密度和新骨形成量之間存在劑量反應關(guān)系。Pieri等[5]研究不同劑量的兔脂肪干細胞復合無機牛骨支架材料對兔顱骨骨缺損區(qū)骨量形成和該區(qū)種植體骨整合的影響，結(jié)果顯示：脂肪干細胞的接種密度和新骨形成量之間存在數(shù)量反應關(guān)系。總體來看，隨著脂肪干細胞密度的增加，種植體周圍新骨形成量也增多。在研究兔后外側(cè)脊柱結(jié)合率的實驗中，也觀察到了類似的數(shù)量反應關(guān)系[6]。在此項研究中，高量BMSC（1×108）與多孔羥基磷灰石材料復合組比低量BMSC（1×106）組的結(jié)合率更高，新骨形成量也更多。

然而在實際的臨床應用中，說服患者為了完成種植牙而抽取自身的骨髓或者脂肪等干細胞含量豐富的組織是有難度的。而誘導多功能干細胞（induced pluripotent stem cell,iPS）有望應用于組織工程骨的構(gòu)建。iPS和ESC在很多方面都相似，但是這兩種類型的細胞又有著本質(zhì)上的不同[7]。Miura等[8]研究證實，小鼠的誘導多能干細胞比小鼠的胚胎干細胞具有更低的畸胎瘤形成率。

2 生長因子

種子細胞的生存狀態(tài)、骨基質(zhì)的分泌、分裂和分化等都受到生長因子的調(diào)節(jié)。盡管目前對這些調(diào)節(jié)的確切機制還不是很清楚，但是生長因子的確是細胞調(diào)節(jié)重要的物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)已明確在骨形成過程中發(fā)揮重要作用的生長因子主要有骨形成蛋白（bone morphogenic proteins，BMPs）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等。

機體正常骨缺損愈合是通過多種生長因子協(xié)同發(fā)揮作用來實現(xiàn)的，單一生長因子的作用有限。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）因含有多種能促進骨組織愈合的生長因子，而被研究者所重視。而且PRP中這些生長因子的濃度比較高，各種生長因子的比例也與機體相似，可以通過生長因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用。Kanno等[9]研究PRP對人成骨樣細胞增殖與分化的影響，在80 d的實驗周期內(nèi)，實驗組細胞的增殖活性和細胞外基質(zhì)合成量均明顯高于對照組。

但是自PRP應用以來，對其安全性和穩(wěn)定性的爭議就一直不斷。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）開始進入研究者的視線。PRF所含生長因子與PRP相似，但是在其制備過程中不需要加入異種血液制品，并且PRF具有纖維蛋白立體結(jié)構(gòu)，可以使生長因子相對穩(wěn)定地保存于其中。Toffler等[10]單獨將PRF作為移植材料應用于上頜竇底提升術(shù)中。選擇了患者

110例，術(shù)前平均竇底高度為6.6mm(4.0～8.0mm)。術(shù)中僅加入PRF，然后共植入種植體138枚，種植位點骨高度平均增加了3.4 mm(2.5～5.0 mm)。術(shù)后11個月，僅3枚種植體脫落，初期保存率為97.8%。

同樣為了使生長因子穩(wěn)定地保存于組織工程骨中發(fā)揮作用，基因工程技術(shù)也被應用于骨組織工程領(lǐng)域了。葉展超等[11]用攜帶BMP-2基因的腺病毒轉(zhuǎn)染犬骨MSCs，再與Bio-Oss支架材料復合構(gòu)建組織工程骨用于犬上頜竇底提升的手術(shù)。與沒有基因強化犬MSCs相比：實驗組的新生骨量(24.74±6.33)mm2明顯多于對照組的(19.67±5.73)mm2。

3 支架材料

骨組織工程的支架材料提供了種子細胞黏附、營養(yǎng)物質(zhì)交換、生長、分裂和分化等的外部微環(huán)境，是組織工程骨的基本框架。因為機體的骨組織經(jīng)過長期的進化選擇，其結(jié)構(gòu)與功能是相對完善的。所以自體骨是天然的骨移植修復的支架材料。但是由于其具有來源有限，需要開辟第二術(shù)野以及對第二術(shù)區(qū)的繼發(fā)影響等缺點，限制了其臨床應用。支架材料經(jīng)歷了單一支架材料、復合支架材料、分層支架材料，目前的發(fā)展趨勢是三維網(wǎng)絡(luò)支架材料。從不可降解材料到可降解材料，從生物惰性材料到生物活性材料，支架材料已經(jīng)越來越接近理想的骨修復支架材料了。各種支架材料各有其優(yōu)缺點，在實際的科研或臨床應用中可以根據(jù)這些材料的特點選擇應用。

目前，科研或臨床常用的單一支架材料主要有生物衍生材料（PRP、PRF、異種脫細胞真皮基質(zhì)、珊瑚、去細胞的異體骨或者異種骨等）和生物替代材料（β-磷酸三鈣、羥基磷灰石、殼聚糖、膠原、聚乳酸羥基乙酸、生物玻璃等）兩大類。許多通過自然聚合或者生物降解與合成的多孔支架材料已經(jīng)應用于組織工程領(lǐng)域了。如周慶梅等[12]采用離子凝膠制備納米微球，微球形態(tài)良好，分散度好，無粘連，粒徑分布以380～650 nm居多。以其作為骨組織工程的支架材料，利于細胞的黏附、伸展、增殖和分化等。

單一材料可能具有無骨誘導性、親水性差、機械強度不足等不符合支架材料特性要求的缺點，而由不同比例構(gòu)成的復合材料可以集中兩種或者兩種以上材料的優(yōu)點，又在一定程度上彌補它們的不足。Takagi等[13]研究用殼聚糖和磷酸三鈣制備支架材料復合體，其理化性質(zhì)與人體骨組織較為接近。

支架材料的設(shè)計追求的是模擬天然組織的結(jié)構(gòu)與功能，而支架材料的分層設(shè)計有可能促進組織的再生。因此立體控制多種異型細胞相互作用的分層支架材料可以支持整體多組織共同體的形成[14]。

比分層支架材料更靠近歷史前沿的是個體化設(shè)計的三維網(wǎng)絡(luò)支架材料。從形式上看，它與患者骨缺損部位的大小和形狀相一致；從內(nèi)容上看，其內(nèi)部復雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠支持組織工程骨植入前的預先血管化。

目前應用組織工程骨修復小面積骨缺損的二維支架材料不需要實現(xiàn)支架材料移植前的預先血管化。其內(nèi)部的種子細胞可以通過周圍毛細血管的彌散作用而獲得生存所必需的養(yǎng)分和氧氣等，新生血管床也可以從組織工程骨移植物的邊緣區(qū)域長入[15]。然而目前用二維支架材料的組織工程骨修復大段骨缺損仍然是十分困難的。究其原因，在很大程度上是因為二維支架材料不能保證大段支架材料中心區(qū)域種子細胞所必須的營養(yǎng)成分和氧氣持續(xù)供給，溫度和pH值的恒定等。而預先血管化的三維支架材料組織工程骨有可能解決這一難題。

這樣矛盾的焦點就轉(zhuǎn)移到如何才能實現(xiàn)三維支架材料的預先血管化上了，而利用機體自身已經(jīng)形成的血管網(wǎng)絡(luò)是一種可能的途徑。例如：把支架材料復合到血管網(wǎng)絡(luò)上，再利用顯微血管外科的技術(shù)手段將此組織工程骨移植到骨缺損區(qū)。

以內(nèi)皮細胞和成骨細胞的共培養(yǎng)來形成血管網(wǎng)絡(luò)是另一種可能的途徑。這就需要支架材料能夠被復制成同樣復雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如果再考慮上細胞與細胞之間，細胞與細胞外基質(zhì)之間復雜的相互關(guān)系，那么設(shè)計這種支架材料將會更加困難。歸納一下目前文獻已報道的復制這種三維支架材料的方法主要有：（1）生物體組織的去細胞化[16]；（2）激光介導細胞植入血管樣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[17]；（3）設(shè)計內(nèi)含微隧道結(jié)構(gòu)的支架材料[18]。

4 展望與不足

盡管在動物模型中用組織工程骨修復頜骨骨量不足是可行的，但是能否用組織工程骨修復人頜骨骨量不足仍需用大量的實驗來證實[19]。如果能用組織工程骨修復人頜骨骨量不足，同樣需要用大量實驗來驗證的是組織工程骨在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸及其遠期療效如何。在組織工程骨真正應用于臨床之前，我們還需要進一步理解骨組織的生長發(fā)育過程，骨組織結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，骨組織受創(chuàng)傷后缺損的自然愈合的確切機制，甚至生物力作用對骨組織修復的影響等。

種子細胞是骨組織工程的基礎(chǔ)，但是我們需要進一步證實是否是種子細胞在形成骨基質(zhì)時起作用或者說它的作用有多大。因為骨缺損的邊緣區(qū)同樣會有機體自身干細胞存在，它是否起作用。如果也起作用，在多大程度上起作用。

既然種子細胞的密度和新骨形成量之間存在劑量反應關(guān)系，那么是否意味著我們繼續(xù)加大接種種子細胞的密度，骨量形成會更多；還是存在一個接種細胞密度的最優(yōu)峰值，如果我們接種比峰值更大細胞密度，骨量形成反而減少。這些疑問尚且需要接種更廣范圍的細胞密度來進一步解決。

生長因子的應用是一把雙刃劍，我們在應用生長因子誘導成骨時也不能忽略其不可避免的副作用。例如：BMP的應用可能會帶來一系列的并發(fā)癥，包括致癌性[20]。那么是否存在一個最適濃度，應用這一濃度的生長因子既能保證有效誘導成骨，又能盡量把其副作用降到最小。對于不同的生長因子、欲應用的不同物種而言，這個最適濃度是否會有差異，每種情況的最適濃度又是多少。能否將生長因子的緩釋系統(tǒng)或者控釋與支架材料有機結(jié)合，使生長因子始終以最適濃度作用于種子細胞。

口腔顱頜面部諸骨具有較為復雜的解剖生理結(jié)構(gòu)，這無疑增加了支架材料的設(shè)計制作難度。而目前的支架材料尚不能滿足骨組織工程支架材料的要求，因此我們期待著更接近于自體骨支架材料的問世。

骨組織的生理結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)代謝與功能等相比機體其它組織要簡單得多，因此組織工程骨很有可能是第一個應用于臨床的組織工程產(chǎn)品。但在這之前，我們?nèi)杂性S多工作要做。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.4.004

北京 100039 武警總醫(yī)院口腔醫(yī)學中心 （朱彪 趙剛 郭希民郭紅延）

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