魏 靜，張建榮

纈沙坦抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對糖尿病腎損害大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用

魏 靜1，張建榮2

目的 探討纈沙坦對糖尿病腎損害大鼠腎臟足細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78、caspase12表達(dá)的影響。方法 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組和實驗組。實驗組大鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，然后隨機(jī)將其分為模型組和纈沙坦組，正常對照組和模型組1次/d給予反滲水灌胃，纈沙坦組1次/d給予纈沙坦(8 mg/kg)灌胃，時間為6周。對nephrin、GRP78、caspase12表達(dá)水平進(jìn)行分析，同時觀察血糖、血尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白定量等指標(biāo)。結(jié)果 建模第6周，模型組大鼠腎臟較正常對照組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，模型組GRP78(6.75±0.65)及caspase12(11.51±0.32)表達(dá)較正常對照組GRP78(1.57±0.39)、caspase12(2.66±0.57)增強(qiáng)(P<0.05)，模型組nephrin(2.29±0.15)較正常對照組(5.71±0.53)表達(dá)減少(P<0.05)。纈沙坦組較模型組凋亡細(xì)胞數(shù)減少，GRP78(3.14±1.00)、caspase12(8.08±2.48)表達(dá)減弱(P<0.05)，nephrin(3.35±0.40)表達(dá)減少較輕(P<0.05)。結(jié)論 纈沙坦通過減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的caspase12凋亡途徑，減少足細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮對糖尿病腎病的保護(hù)作用。

糖尿病腎?。粌?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；足細(xì)胞凋亡；nephrin蛋白；纈沙坦

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，蛋白尿是其主要臨床表現(xiàn)，也是引起腎臟損傷的獨立危險因素。因此,對于蛋白尿發(fā)生機(jī)制的研究尤為重要。腎小球臟層上皮細(xì)胞足細(xì)胞損傷、凋亡在蛋白尿的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條重要的凋亡途徑。血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ，AT2)可以通過血流及非血流動力學(xué)因素在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，纈沙坦為血管緊張素受體阻滯藥 (angiotensin receptor blocker，ARB),通過阻斷AT2與其受體結(jié)合從而起到腎臟保護(hù)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)的一個精細(xì)的膜系統(tǒng)，對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起重要作用。其基本生理功能包括蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運、信號肽識別、糖基化修飾等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提供了高保真質(zhì)量控制系統(tǒng)以保證只有正確折疊的蛋白才可以被運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)外。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡時即ERS。纈沙坦的保護(hù)作用是否可能通過抑制ERS繼而減少腎臟足細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)？本研究通過觀察纈沙坦對糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞凋亡以及ERS標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulate protein78，GRP78)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12 (caspase12)的影響，旨在研究此種保護(hù)作用是否可以通過減少細(xì)胞凋亡實現(xiàn)，繼而以阻斷或抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路為契點發(fā)現(xiàn)新的治療糖尿病腎病的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只8周齡SD雄性大鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ，Sigma 公司)、兔抗鼠GRP78抗體(武漢博士德生物工程公司)、兔抗鼠nephrin抗體(武漢博士德生物工程公司)、兔抗鼠caspase12抗體(武漢博士德生物工程公司)、纈沙坦(8 mg/kg，商品名代文，北京諾華制藥有限公司)。

1.3 實驗儀器 電子天平(上海天平儀器廠，型號HA 1004)、超速離心機(jī)(日本日立公司，型號CP80WX)、全自動生化分析儀(日本日立公司，型號7080型)。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備及給藥方法 隨機(jī)選取10只大鼠作為正常對照組，余20只大鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素 (streptozotocin，STZ) 50 mg/kg ，用pH4.28枸櫞酸鈉緩沖液配制。48 h后血糖≥16.7 mmol/L，尿糖3+至4+確定為糖尿病模型。將20只大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、纈沙坦組(10只)。纈沙坦組每天按8 mg/kg灌胃，正常對照組和模型組只灌反滲水。實驗期間動物自由進(jìn)水、飲食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.4.2 觀察指標(biāo) 實驗期間，每日觀察大鼠的飼料消耗情況，飲水量、尿量、毛發(fā)及體重變化情況。于第6周稱重后用代謝籠收集24 h尿，3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清，測定血糖 (blood glucose，BG)、血尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN)、肌酐 (creatinine，Cr)、24 h尿蛋白定量。切取腎臟，稱重后部分置于福爾馬林溶液中留做HE染色，部分留做冰凍標(biāo)本用于western blot。腎組織病理學(xué)觀察：腎組織石蠟包埋后切片4 μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

Western blot 檢測nephrin、GRP78和caspase12蛋白的表達(dá)：取腎皮質(zhì)組織放入冰冷的研磨器，加入蛋白裂解液提取蛋白，用酶連法測定蛋白定量，-70 ℃保存，每個樣品取5 μl總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉搖床振蕩2 h，4 ℃封閉過夜，再分別加入兔抗nephrin、GRP78、caspase12抗體、鼠抗GAPDH抗體孵育過夜。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。Western blot信號強(qiáng)度應(yīng)用Image J軟件對Western條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和GAPDH條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett′T檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模成功后，與正常對照組相比，模型組、纈沙坦組大鼠精神萎靡，毛色暗淡，反應(yīng)遲緩，多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀明顯。給予纈沙坦后，纈沙坦組上述情況均有改善。

2.2 生化指標(biāo) 模型組大鼠BG維持在較高水平；24 h尿蛋白定量、Cr水平較正常對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，纈沙坦組與模型組相比，上述生化指標(biāo)均顯著降低(表1)。與正常對照組比較，纈沙坦組與模型組大鼠腎重均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，纈沙坦組與模型組比較身重升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表1 正常對照組和糖尿病腎損害組大鼠血糖、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量的比較 (n=10；±s)

注：與正常對照組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05

表2 正常對照組和糖尿病腎損害組大鼠腎重、身重、 腎重/身重的比較 (n=10；

注：與正常對照組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05

2.3 對DN大鼠腎臟組織病理改變的影響

2.3.1 HE染色 HE染色顯示，正常對照組大鼠腎小球球囊壁光滑，未見增生及纖維化。毛細(xì)血管叢呈小葉狀分布，毛細(xì)血管腔清晰，腎小管管腔規(guī)則，管壁上皮細(xì)胞未見腫脹、壞死及脫落，間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤，無纖維組織增生。模型組大鼠見腎小球體積增大，基底膜增厚及系膜基質(zhì)增多，腎小球內(nèi)可見散在炎細(xì)胞浸潤。部分毛細(xì)血管腔受壓變窄，部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿疏松，輕度水腫。纈沙坦組部分毛細(xì)血管叢基底膜稍增厚及系膜區(qū)稍增寬，腎小球內(nèi)炎細(xì)胞浸潤較模型組減少。腎小管及間質(zhì)病變不明顯(圖1)。

圖1 正常對照組和糖尿病腎損害組大鼠光鏡下腎臟病理(HE×200)

2.3.2 Western蛋白印跡結(jié)果 與正常對照組相比，模型組nephrin表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，GRP78和caspase12蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組相比，纈沙坦組nephrin表達(dá)上調(diào)，GRP78和caspase12蛋白表達(dá)水平則降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 正常對照組和糖尿病腎損害組大鼠腎臟組織的

3 討 論

足細(xì)胞是腎小球中一種獨特、終末分化的細(xì)胞，分化成熟后一般不會再生。糖尿病時，高血糖、高血壓等多種因素可導(dǎo)致足細(xì)胞脫落或凋亡，繼而出現(xiàn)尿蛋白。足細(xì)胞相鄰的足突之間有直徑為30～40 nm的裂孔，孔上覆蓋一層厚4～6 nm的隔膜，即裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)。SD的完整性決定腎小球濾過屏障的通透性。Nephrin特異地表達(dá)于足細(xì)胞，并定位于其SD區(qū)域，是構(gòu)成腎小球濾過屏障的關(guān)鍵分子，其表達(dá)及分布異常會導(dǎo)致不同程度蛋白尿的發(fā)生。研究證實，人類DN時nephrin mRNA及其蛋白表達(dá)下降，繼而可以引起足細(xì)胞及裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷，并隨腎臟病變的惡化進(jìn)一步加劇[1]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組nephrin蛋白的表達(dá)下降，同時腎功能發(fā)生變化，提示在糖尿病腎病過程中SD區(qū)域的nephrin表達(dá)及結(jié)構(gòu)的變化可引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能改變，繼而導(dǎo)致腎小球濾過屏障被破壞、出現(xiàn)蛋白尿及腎功能損害。

凋亡是足細(xì)胞丟失的主要原因，在糖尿病腎病早期即可發(fā)生[2,3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是控制蛋白質(zhì)量的場所。多種因素均可引起ER內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力，時間過長、過強(qiáng)的ERS則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在生理和病理情況下均會存在，且是細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因子[4]，它不僅可以導(dǎo)致蛋白尿，還在蛋白尿?qū)е碌哪I功能損害中發(fā)揮重要作用[5]。研究表明，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致腎細(xì)胞凋亡進(jìn)而在DN進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[6]。本研究結(jié)果表明，6周末DM大鼠腎組織中細(xì)胞凋亡數(shù)目較正常對照組明顯增多，表明腎臟固有細(xì)胞過多凋亡可能是導(dǎo)致糖尿病腎臟損害和腎功能進(jìn)一步惡化的重要原因。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，生理情況下，GRP78在基礎(chǔ)水平表達(dá)，它被廣泛認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性分子[7,8]。Caspase-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，在膜受體或線粒體凋亡途徑中不被活化[8,9]。本研究結(jié)果表明，6周時，模型組SD大鼠出現(xiàn)明顯血糖升高，24 h尿蛋白、肌酐水平升高及腎小球體積增大，基底膜增厚及系膜物質(zhì)增多、腎小球散在炎細(xì)胞浸潤、足細(xì)胞明顯減少等一系列糖尿病腎病表現(xiàn)；而GRP78、caspase12的表達(dá)增多均提示腎臟此時處于應(yīng)激狀態(tài)，并可能通過caspase12凋亡途徑介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。但是，我們的研究并未進(jìn)行凋亡相關(guān)的檢測，在后續(xù)的研究中需進(jìn)行ELISA、TUNEL等相關(guān)檢測凋亡的實驗。另外，本研究中未進(jìn)行腎小球面積測量，不能充分證明模型組和纈沙坦組腎小球體積的絕對增大，這是本研究的不足之處。

血管緊張素Ⅱ受體阻滯藥(ARB)是目前治療DN蛋白尿的主要藥物。傳統(tǒng)研究認(rèn)為，纈沙坦作為ARB類藥物通過阻斷AT2與其受體結(jié)合而抑制AT2的致病作用，通過血流動力學(xué)效應(yīng)和非血流動力學(xué)效應(yīng)發(fā)揮腎保護(hù)作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，ARB類藥物有獨立于降壓作用以外的腎臟保護(hù)作用。Davis等[10]發(fā)現(xiàn)，纈沙坦可阻止動物nephrin表達(dá)的下調(diào)，其白蛋白尿的程度與nephrin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。同時有研究亦發(fā)現(xiàn)，纈沙坦可降低尿蛋白排泄率，并阻止nephrin表達(dá)的下調(diào)從而起到對足細(xì)胞的保護(hù)作用，且尿白蛋白排泄率與nephrin表達(dá)呈相關(guān)性[11]。陳玉鳳等[12]發(fā)現(xiàn)，替米沙坦對ERS介導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，能夠顯著的減少尿蛋白，改善腎功能。

綜上所述，纈沙坦組由STZ導(dǎo)致的腎臟病理損害得到了明顯改善，24 h尿蛋白定量和Cr也明顯下降,表明其對糖尿病腎病時的腎臟保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用可能是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激繼而減少腎臟足細(xì)胞的凋亡起作用的。GRP78、caspase12及生化指標(biāo)的改變則證實纈沙坦可能通過抑制ERS誘導(dǎo)的凋亡途徑參與其在高糖環(huán)境下對足細(xì)胞的保護(hù)作用。進(jìn)一步檢測ERS誘導(dǎo)的凋亡途徑在糖尿病腎病中的地位，以及是否可以通過干擾ERS不同環(huán)節(jié)減少細(xì)胞凋亡繼而起到腎保護(hù)作用仍需繼續(xù)研究。

[1] Toycda M, Suzuki D. Expression of human nephrin mRNA in diabetic nephropathy[J]. Nephrol Dial Transplant,2004,19(3):380-385.

[2] Butt A, Riaz S.Study of protein profiling of human urine in diabetic hypertensive nephropathy versus normal healthy controls[J].Diabetes Technol Ther, 2010,12(5):379-386.

[3] Chen M, Felix K, Wang J.Immune regulation through mitochondrion-dependent dendritic cell death induced by T regulatory cells [J].J Immunol,2011,187(11):5684-5692.

[4] Ron D, Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007, 8(7):519-529.

[5] Kriz W. Progressive renal failure-inability of podocytes to replicate and the consequences for development of glomerulosckerosis[J].Nephrol Dial Transplant,1996,11(9):1738-1742.

[6] Liu G, Sun Y, Li Z,etal. Apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress involved in diabetic kidney disease [J].Biochem Biophys Res Commun,2008，13，370(4):651-656.

[7] Schroder M, Kaufman R J.The mammalian unfolded protein response[J]. Annu Rev Biochem,2005,74:739-789.

[8] Ni M, Lee A S.Echaperones in mammalian development and human diseases[J].FEBS Lett,2007,581(19):3641-3651.

[9] Ohse T, Inagi R, Tanaka T,etal. Albumin induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in renal proximal tubular cells[J].Kidney Int,2006,70(8)：1447-1455.

[10] Davis B J, Cao Z, Gaparo M,etal.Disparate effects of angiotensin Ⅱ antagonists and calcium channel blockers on albuminuria in experimental diabetes and hypertension:potential role of nephrin[J]. Hypertens,2003,21(1):209-216.

[11] Davis B J, Forbes J M, Thomas M C,etal.Superior renoprotective effects of combination therapy with ACE and AGE inhibition in the diabetic spontaneously hypertensive rat[J].Diabetologia,2004,47(1):89-97.

[12] 陳玉鳳,張會娟,沈育芬,等.替米沙坦對糖尿病大鼠腎臟組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2011,27(9):849-852.

(2015-05-08收稿 2015-07-20修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Protective effect of valsartan on glomerular podocyte apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in diabetic nephropathy rats

WEI Jing1and ZHANG Jianrong2.

1.Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China；2. Department of Nephrology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China

Objective To evaluate the effect of valsartan on apoptosis of podocytes，GRP78 which serve as a symbolic protein of endoplasmic reticulum stress (ERS) and caspase12 in diabetic rats. Methods Male SD rats were randomly divided into normal group and study group.The animal models with diabetes were established in study group by STZ intraperitoneal injection,then the study group were randomly divided into model group and valsartan group.Water was aiministered daily by gavage to normal group and model group.Valsartan was administered daily by gavage to valsartan group for 6 weeks. The levels of protein of nephrin、GRP78，caspase 12.BG，Cr ，BUN and 24-hour urinary protein quantity were checked. Results At the time of 6 weeks，compared with those in normal group，the number of apoptosis cells were much higher in the model kidneys，the expression of GRP78(6.75±0.65),caspase 12 (11.51±0.32)in the model kidneys were much higher than GRP78(1.57±0.39)，caspase12(2.66±0.57)in the normal group(P<0.05);however, the expression of nephrin in the model group(2.29±0.15)was lower than in the normal group(5.71±0.53)(P<0.05). While in the valsartan group,reductions were found in the expression of GRP78(3.14±1.00)，caspase12 (8.08±2.48)and the number of apoptotic cells(P<0.05),the expression of nephrin (3.35±0.40)was higher(P<0.05). Conclusions Valsartan can depress the effect of endoplasmic reticulum stress and reduce the apotosis of the podocytes in the development of diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy; endoplasmic reticulum stress; apoptosis; nephrin; valsartan

國家自然科學(xué)基金面上項目(81273706)

魏 靜，碩士研究生，E-mail:mengyiyuan1256@163.com

1.221004，徐州醫(yī)學(xué)院，2.100039 北京，武警總醫(yī)院腎內(nèi)科

張建榮，E-mail:zhangjr0317@126.com

R587.1