朱 彪，趙 剛，徐紅梅，郭希民，郭紅延

以BMSCs為基礎(chǔ)構(gòu)建組織工程骨修復種植區(qū)骨量不足的實驗研究

朱 彪1，趙 剛2，徐紅梅1，郭希民2，郭紅延1

目的 評價以骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)為基礎(chǔ)構(gòu)建組織工程骨修復種植體周圍骨缺損的成骨效果。方法 在3只犬雙側(cè)下頜前磨牙區(qū)各植入2顆種植體，分為對照組和實驗組，每組6顆種值體；在種植體遠中制備骨缺損，對照組每側(cè)骨缺損區(qū)隨機植入富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)和實驗組成骨誘導培養(yǎng)BMSCs復合PRP。分別于移植后1、3個月取材，行大體、影像學及組織學觀察。結(jié)果 1個月后，實驗組可見較多的骨基質(zhì)，較少的膠原纖維。實驗組骨密度值大于對照組(101±8.99)vs(93±9.81),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3個月后，實驗組可見較多的哈弗系統(tǒng)，實驗組與對照組骨密度值變化不大(100.75±12.05)vs(105±11.58)，差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 以BMSCs為基礎(chǔ)的組織工程骨能在種植體周圍較好地成骨。

骨髓間充質(zhì)干細胞；組織工程骨；口腔種植

種植修復已成為牙列缺損或牙列缺失患者首選的修復方式，然而種植修復需要種植區(qū)有足夠的骨量支持，只有骨量充足，種植體才能與骨形成骨結(jié)合。種植體周圍骨缺損是影響種植體成功的一個重要因素。有學者將組織工程骨應用于修復種植體周圍骨缺損，取得了一定的進展[1-3]。具有多向分化潛能的種子細胞是組織工程骨的基礎(chǔ)，BMSCs是理想的種子細胞。PRP因含有多種高濃度的生長因子，可加快成骨速度，提高成骨質(zhì)量。將其單獨或聯(lián)合其他生物材料注入硬組織缺損或軟組織創(chuàng)傷處，可以修補缺損、誘導生長、加速局部創(chuàng)傷的愈合并提高愈合質(zhì)量[4,5]。本研究在這些實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過BMSCs復合PRP構(gòu)建組織工程骨來修復種植體周圍骨缺損，并評價BMSCs在新骨形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Beagle犬3只，1歲左右，體重10～15 kg，雌雄不限，普通級，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑 α-MEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，Percoll分離液(GE),高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，β-甘油磷酸鈉(Sigma),左旋維生素C(Sigma),地塞米松(Sigma)，L-谷氨酰胺(Sigma)，PRP(采用同一條犬的自體血經(jīng)兩步離心法制備)，牛凝血酶(Sigma)，堿性磷酸酶試劑盒(中杉金橋)，進口脫鈣液(中杉金橋)，Masson染色試劑盒(中杉金橋)，青鏈霉素(華北制藥)。

1.3 實驗方法

1.3.1 犬BMSCs的分離、培養(yǎng)、擴增與成骨誘導 2%戊巴比妥靜脈推注麻醉(1.5 ml/kg)Beagle犬后，雙側(cè)髂骨抽取骨髓液3 ml。肝素抗凝后Percoll(密度為1.063 g/ml)梯度離心，5 min。716×g，吸取中間單核細胞層以α-MEM培養(yǎng)基洗滌2次，接入25 cm2培養(yǎng)瓶中以含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中(5%CO2，95%O2，100%飽和濕度)培養(yǎng)，3 d后首次換液，以后每隔2 d換液。

約10 d后，細胞長滿70%～80%，0.05%胰酶消化、傳代擴增。待第2代細胞長滿約80%左右時加入成骨誘導液培養(yǎng)。誘導7 d后行堿性磷酸酶(ALP)染色，誘導14 d后行Von Kossa染色。

1.3.2 MTT檢測 BMSCs成骨誘導3 d，胰酶消化后制備成單細胞懸液，以每孔1.0×103個細胞的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，每 2 d更換培養(yǎng)液。接種后的1～11 d，每天固定時間取出培養(yǎng)板，實驗孔(6個復孔)中各加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，于酶聯(lián)免疫檢測儀波長492 nm處(以空白孔調(diào)零)測量實驗孔的吸光值(OD值)。

1.3.3 血小板計數(shù)與PRP制備 無菌條件下抽取16 ml犬靜脈血于EDTA抗凝真空采血管中，1 ml做血細胞分析計數(shù)血小板；15 ml兩步離心法制作PRP：(1)402×g，10 min。吸取上層血漿(約2.1 ml)于另一離心管中；(2)1610×g，10 min。吸棄上部血漿(約1.5 ml),剩余即為PRP(約0.6 ml)，取10 μl PRP做血細胞分析計數(shù)血小板(需稀釋至1 ml)。

1.3.4 組織工程骨的制備 0.05%胰酶消化成骨誘導3 d后的BMSCs(P2代)，258×g，5 min，吸棄上部液體留細胞沉淀備用。將0.6 ml PRP均分為3份，0.2 ml PRP重懸自體BMSCs(約5×106個細胞，P3代) ，并加入0.1 ml激動藥(1000 U牛凝血酶溶于1 ml 10%的CaCl2溶液)即制備成組織工程A；另取0.2 ml PRP直接加入0.1 ml激動藥，制備成不含細胞的組織工程骨B。所有制備成的組織工程骨均在10 min內(nèi)植入動物體內(nèi)。

1.3.5 制備骨缺損模型與植入組織工程骨 微創(chuàng)拔除Beagle犬下頜雙側(cè)4顆前磨牙后，嚴密縫合，待拔牙創(chuàng)自然愈合。3個月后全麻下全層切開前磨牙區(qū)牙槽頂上的粘骨膜，在大量冰生理鹽水(4 ℃)沖洗降溫條件下，于雙側(cè)牙槽嵴頂處定點鉆孔，逐級擴孔，雙側(cè)各制備2個種植窩。在每個種植窩的遠中，緊鄰種植窩制備5 mm×5 mm×5 mm大小的立方體狀骨缺損。植入種植體(SIC,瑞士)，將組織工程骨A、B隨機植入到Beagle犬一側(cè)下頜骨從近中至遠中的骨缺損處，分組情況如圖1示。

嚴密縫合粘骨膜瓣，術(shù)后3 d，流質(zhì)飲食。并給予青霉素100 萬U，每日2次，肌注。

圖1 3條Beagle犬骨缺損區(qū)植入物

▲代表組織工程骨A植入后1個月取材；■代表組織工程骨B植入后1個月取材；△代表組織工程骨A植入后3個月取材，□代表組織工程骨B植入后3個月取材。

1.3.6 樣本采集與大體觀察、X線分析和組織學分析 種植術(shù)后1個月和3個月分別處死1條Beagle犬。另1條Beagle犬雙側(cè)種植手術(shù)于不同的時間點完成：一側(cè)下頜骨種植手術(shù)后2個月進行對側(cè)種植手術(shù)，再過1個月處死該犬。

取附有種植體的下頜骨標本，進行(1)大體觀察：種植體的穩(wěn)定度，骨缺損區(qū)的組織愈合情況和成骨情況，有無炎癥反應等。(2)拍攝前磨牙區(qū)側(cè)位根尖片(PROX,韓國；60 kV,2 mA,0.1 s)，盡量使X線發(fā)射球管與下頜骨的近遠中平面垂直。再將根尖片導入Trophy Windows 5.0軟件進行骨密度分析，每張根尖片重復測量3次取均值。(3)然后將標本放入4%多聚甲醛中固定48 h后，脫離種植體，觀察種植體-骨界面的骨結(jié)合情況。再將標本浸入進口脫鈣液中脫鈣48 h,水洗，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，烤片后脫蠟，水化，按Masson染色試劑盒說明行Masson染色(未進行黑核染色)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，定義P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs生長、增殖情況 原代培養(yǎng)后第7天，細胞即增殖為集落。細胞形態(tài)似短的成纖維細胞，有長短不同的突起。傳代后細胞增殖迅速，胞體略增大，以成纖維細胞集落樣方式生長，有形成旋渦的趨勢。

2.2 成骨誘導與ALP染色、Von Kossa染色 用成骨誘導液培養(yǎng)第2代細胞，見細胞分泌基質(zhì)增多。第7天行ALP染色，實驗組可見廣泛的藍染區(qū)域，呈網(wǎng)狀交織，對照組僅少量藍染區(qū)域(圖2)。第14天Von Kossa染色，可見細胞密集區(qū)域顆粒狀黑染結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)已礦化或者正在礦化(圖3)。

2.3 MTT檢測 BMSCs的生長趨勢呈S形，可以分為3個階段：細胞接種后的前3 d增殖緩慢；從第4天開始增殖加速。在第6、7天增殖加速最快，曲線顯示此階段細胞數(shù)目不斷增加，直至第10天達到頂點；此后細胞數(shù)量開始減少。

圖2 ALP染色(倒置像差顯微鏡，×10)

圖3 Von Kossa染色(倒置像差顯微鏡，×10)

2.4 PRP中血小板計數(shù) 各實驗組PRP中血小板數(shù)目分別為對應全血中血小板數(shù)目的10.13～14.72倍。

2.5 大體觀察 所有Beagle犬沒有因意外死亡而退出實驗者，所植種植體均無松動、脫落。種植區(qū)黏膜無紅腫，無膿腫形成等局部炎癥反應。組織工程骨修復區(qū)未見明顯的免疫排斥反應。

2.6 組織學分析 1個月時，組織工程骨B修復區(qū)可見與種植體嵌合的螺紋結(jié)構(gòu)，骨缺損區(qū)充填有大量的膠原纖維結(jié)締組織(Masson染色中膠原纖維等纖維結(jié)締組織呈藍色)，大量不規(guī)則的骨髓腔和少量不成形的類骨質(zhì)(Masson染色中類骨質(zhì)、角質(zhì)等組織呈紅色)，未與種植體發(fā)生骨結(jié)合；組織工程骨A修復區(qū)可見大量的膠原纖維結(jié)締組織，較少量的不規(guī)則骨髓腔和少量不成形的類骨質(zhì)，未與種植體發(fā)生骨結(jié)合，但已不能見到與種植體嵌合的螺紋結(jié)構(gòu)。

3個月時，組織工程骨B修復區(qū)冠方可部分見到與種植體嵌合的螺紋結(jié)構(gòu)，骨缺損區(qū)充填有大量成熟的類骨質(zhì)(有形成Haversian系統(tǒng)的趨勢)，少量的纖維結(jié)締組織和數(shù)量減少、直徑變小、不規(guī)則的骨髓腔，骨缺損區(qū)根方與種植體發(fā)生了骨結(jié)合；組織工程骨A修復區(qū)有大量成熟的類骨質(zhì)，并可見已經(jīng)形成和正在形成的Haversian系統(tǒng)，少量的纖維結(jié)締組織和骨髓腔，絕大部分區(qū)域與種植體發(fā)生了骨結(jié)合，見圖4。

2.7 骨密度分析 對骨密度值進行單因素方差分析：植入后即刻差異無統(tǒng)計學意義(P=0.78)；植入后1個月差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)，組織工程骨A、B修復區(qū)的骨密度值不同；植入后3個月差異無統(tǒng)計學意義(P=0.12)，組織工程骨A、B修復區(qū)的骨密度值相同,見表1。

表1 組織工程骨修復骨缺損區(qū)骨密度值 ±s)

注：n=16，圓括號內(nèi)數(shù)據(jù)為95%可信區(qū)間下限與上限

圖4 組織工程骨修復區(qū)組織切片染色(倒置像差顯微鏡，×4)

A.移植后1個月PRP修復區(qū)組織切片Masson染色；B.移植后1個月自體BMSC組織工程骨修復區(qū)組織切片Masson染色；C.移植后3個月PRP修復區(qū)組織切片Masson染色；D.移植后3個月自體BMSC組織工程骨修復區(qū)組織切片Masson染色

3 討 論

骨組織工程的迅速發(fā)展為種植體周圍缺損的修復提供了新的方法和思路。組織工程骨主要包括向成骨方向誘導分化的間充質(zhì)干細胞,具有引導成骨作用的支架材料和具有誘導、調(diào)節(jié)作用的生長因子[6]。其構(gòu)建策略主要包括以細胞為基礎(chǔ)的組織工程骨構(gòu)建和以生長因子為基礎(chǔ)的組織工程骨構(gòu)建[7]。以細胞為基礎(chǔ)的組織工程骨構(gòu)建又有細胞、支架材料復合或者不復合生長因子兩種基本方法；以生長因子為基礎(chǔ)的組織工程骨構(gòu)建有生長因子與支架材料或者自體骨復合兩種基本方法。

本研究采用細胞、支架材料和生長因子(PRP)構(gòu)建組織工程骨A作為研究組，以支架材料和生長因子(PRP)構(gòu)建組織工程骨B作為對照組，探討細胞在新骨形成中的作用。結(jié)果表明組織工程骨中的干細胞在新骨形成起作用，并且在植入初期起的作用大于后期，這與趙健等[8]的研究結(jié)果一致。其原因主要為：(1)大體觀察表明，組織工程骨A與種植體無論是生物結(jié)合還是骨結(jié)合都比同期組織工程骨B更多、更緊密；(2)骨密度分析顯示，組織工程骨A修復區(qū)密度值大于同期組織工程骨B；并且隨時間的推移，差值在減小；(3)組織學觀察表明，組織工程骨A修復區(qū)比同期組織工程骨B修復區(qū)新骨形成量更多，骨質(zhì)更成熟，膠原纖維更少。其可能的機制是：組織工程骨植入初期，干細胞在骨缺損區(qū)直接參與了損傷修復或者通過自身分泌的生長因子調(diào)動機體更快地啟動了損傷修復機制，而在后期機體的損傷修復已經(jīng)開始，機體自身的干細胞也會遷移到骨缺損區(qū)分化為成骨細胞參與損傷修復，這還有待于進一步探討。但是無論哪種組織工程骨對于骨缺損的修復都是正向促進成骨作用[3]。

組織工程骨的移植包括兩條不同的技術(shù)路線[9]，一種是體外將種子細胞接種于支架材料進行成骨誘導培養(yǎng)，然后進行移植；另一種是將種子細胞與可降解的支架材料復合物直接移植到體內(nèi)誘導目標組織形成。BMSCs是骨組織工程理想的種子細胞，因為它能分化為成骨細胞和成軟骨細胞[10]。同時，由于BMSCs可被誘導成多種細胞，若將其直接植入體內(nèi)，其分化方向可能不確定，因此本研究采用將BMSCs進行體外成骨誘導后再行體內(nèi)移植的技術(shù)路線。根據(jù)細胞增殖曲線，成骨誘導后的細胞從第3天開始進入快速增殖期，因此本研究采用成骨誘導3 d后的干細胞作為種子細胞。一般而言，成骨細胞具有以下標志：表達ALP，合成骨基質(zhì)蛋白，體外可以形成鈣化結(jié)節(jié)，體內(nèi)可成骨等。本研究從兩個方面驗證了BMSCs的體外成骨潛能：ALP是參與礦化組織再生的一種功能標志酶，在成骨初期大量表達。本研究中成骨誘導7 d的干細胞，可見ALP表達陽性，提示了骨生成的開始。成骨的最終環(huán)節(jié)是胞外基質(zhì)的礦化，本研究中成骨誘導14 d的干細胞，Von Kossa染色呈陽性表現(xiàn)，提示結(jié)節(jié)中有鈣鹽沉積。

組織工程骨要選取合適的支架材料，支架材料相當于天然骨組織中胞外基質(zhì)中的無機部分。多種生物材料(如TCP、殼聚糖和PLGA等)已被用于制備骨組織工程的支架材料。用支架材料的是PRP凝膠中纖維蛋白交聯(lián)成的網(wǎng)絡(luò)支架，它是一種天然的支架材料[11]。然而PRP不僅僅是支架材料，它還提供了大量的血小板來源的生長因子,主要有血小板生長衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)，轉(zhuǎn)移生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和類胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)等。PRP是通過兩次離心濃縮獲得，文獻中報道的PRP中血小板較全血中血小板濃縮倍數(shù)相差很大，但至少濃縮5倍才能稱為富血小板血漿。本研究中PRP中血小板數(shù)目均為對應全血中血小板數(shù)目的10倍以上，為本研究奠定了良好的基礎(chǔ)。此外，PRP中釋放出來的生長因子與干細胞表面的膜受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學效應，并不進入胞內(nèi)，不會引起細胞遺傳性狀的改變[12]。但是，PRP對骨缺損愈合的作用一直存在爭議。有研究表明，PRP對骨缺損愈合不但不起作用，甚至起反向抑制作用[3,13,14]。爭議原因可能是各研究中PRP的制備方法各異，而不同的濃縮方法導致血小板的濃縮倍數(shù)明顯不同，不同的血小板濃縮倍數(shù)又不可避免地引起各類生長因子的濃縮倍數(shù)不同[15]。如前所述，本研究中PRP(組織工程骨B)能夠促進骨缺損愈合。

種植體周圍骨缺損模型主要有三種：種植體頰側(cè)V形裂開式骨缺損，種植體周圍環(huán)形骨缺損和種植體側(cè)壁開放式骨缺損。本研究制造的植體側(cè)方開放式骨缺損是種植臨床中最常見的缺損類型。骨缺損的一個側(cè)壁為種植體，部分中斷了組織工程材料的骨傳導性，這樣組織工程材料的骨誘導性就顯得尤為重要。本研究中組織工程骨修復種植體周圍骨缺損的效果比較明顯，其PRP中血小板來源的生長因子可能起了重要作用，這也有待于進一步探討。

綜上所述，本研究通過BMSCs復合PRP構(gòu)建組織工程骨成功用于修復種植體周圍骨缺損，初步評估了這種新型的骨移植替代材料在骨缺損修復中的潛在價值。組織工程骨中的干細胞在骨缺損修復中起作用，并且在移植初期的作用大于后期，具體機制有待進一步探討。

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(2015-03-30收稿 2015-08-10修回)

(責任編輯 梁秋野)

BMSCs-based tissue-engineering bone repairing bone defect in dental implant region:an experimental study

ZHU Biao1, ZHAO Gang2, XU Hongmei1, GUO Ximin2, and GUO Hongyan1.

1.Stomatology Center,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039, China; 2. Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China

Objective To repair bone defect in implant region using bone marrow mesenchymal stem cells-based tissue-engineering bone and investigate its osteogenesis potential. Methods Bilateral implantaion,two implants every side, was performed in the mandible premolar region of 3 Beagles and bone defects were created in the distal of every implant.Two bone defects in one side of mandible premolar region were randomly repaired with two types of grafts: PRP (n=6, the control group);and compound osteogenic-induced BMSCs with PRP(n=6, the experimental group). 1 and 3 months after transplation, gross investigation,X-ray examination and histological observation were conducted to examine bone formation. Results One month after implantation,the osteogenesis in experimental group was better than in the control group. We detected more bone matrix and less collagenous fibers in the experimental group.The bone density in the experimental group was higher than in the control group and the difference was significantly different[(101±8.99)vs(93±9.81),P≤0.05].Three months after implantation,the bone density in the experimental group tended to be higher than in the control group; however,the difference was not statistically significant[(100.75±12.05)vs(105±11.58)].But we detected more Haversian system in the experimental group. Conclusion Bone marrow stem cell-based tissue-engineered bone has high osteogenic potential around implants.

bone marrow mesenchymal stem cells; tissue-engineered bones; oral implantology

朱 彪，碩士研究生，E-mail:zhubiao19860320@sina.com

1.100039 北京，武警總醫(yī)院口腔醫(yī)學中心；2.100850 北京，軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所

郭紅延，E-mail:ghyfmmu@126.com

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