康宜兵，呂永慧，吳宇金，鐘志勇，武 昕

(1.廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣東 廣州 510000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

免疫復(fù)合型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究*

康宜兵1，呂永慧1，吳宇金1，鐘志勇2，武 昕2

(1.廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣東 廣州 510000)

目的 建立免疫復(fù)合型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型并探討其應(yīng)用價(jià)值。方法 20只SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照A組10只、模型組10只。模型組用大鼠頸、背部皮下注射抗原乳化液，第23天，造模組大鼠TNBS灌腸?？瞻讓φ战M以生理鹽水灌腸，比較各組大便的性狀、便血程度、體重下降情況，并進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果 UC模型大鼠體重減輕，體重增長緩慢(P>0.05)。血清IL-10水平降低(P<0.05)。大便的性狀評分、CMDI評分均升高(P<0.01)。結(jié)論 免疫復(fù)合型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，該模型成功率高，重復(fù)性好，且模型的病變機(jī)制與人類UC相符，是較為理想的潰瘍性結(jié)腸炎動物模型。

潰瘍性結(jié)腸炎；大鼠；動物模型

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種主要累及直腸、結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎癥。在動物試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯糠矫?，近年來開展的UC的實(shí)驗(yàn)動物模型有化學(xué)誘導(dǎo)模型、免疫致敏模型、細(xì)胞移植模型和基因敲除模型等，其中TNBS 誘導(dǎo)、單純免疫法及免疫復(fù)合法3種UC大鼠模型較為常用。免疫復(fù)合法模型的致病機(jī)制是在全身致敏的基礎(chǔ)上給TNBS，導(dǎo)致遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)造成腸黏膜的損傷，達(dá)到全身免疫異常與局部炎癥病變的結(jié)合。雖然制作方法稍復(fù)雜，但免疫復(fù)合法重復(fù)性好，病變更類似人UC，持續(xù)時(shí)間長，是較理想的造模方法。免疫復(fù)合法模型病變累及全結(jié)腸以及末段回腸，潰瘍病變可維持8周以上，12周后有愈合傾向，但仍可見結(jié)腸壁增厚及炎性細(xì)胞浸潤[1]。本研究通過建立免疫復(fù)合型UC大鼠模型，為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物 SD大鼠，SPF級，20只，雄性(SD大鼠)，180～200 g；新西蘭兔，普通級，3只，雄性(新西蘭兔)，體重3kg左右(新西蘭兔)。

1.2 主要儀器 倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司，CKX41)，超凈工作臺(蘇州凈化有限公司，SW-CJ-2FD)，恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司，HWS-28)，振蕩器(德國IKA公司產(chǎn)品，MS 3 digital)，低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，KDC-2046)，全波長酶標(biāo)儀(Thermo，Multiskan GO)，BS-3000A系列電子天平(精度0.1 g，上海友聲衡器有限公司)，BS224S電子分析天平(感量0.0001 g，德國Sartorius)。

1.3 主要試劑 生理鹽水(江西科倫有限公司，XB1402101)，冰醋酸(廣州市中南化學(xué)試劑有限公司，090103)，無水乙醇(廣州市中南化學(xué)試劑有限公司，101004)，雙縮脲總蛋白測定試劑盒(廣州上諾生物技術(shù)有限公司，20140916)，大鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，E24015334)，消康保便隱血檢測試紙(膠體金法)(萬華普曼生物工程有限公司，14100058)，PBS(1128A14，佛山泰爾健生物科技有限公司)，胰酶(14092301，廣州威佳科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 檢疫合格的20只SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照A組10只、模型組10只。

1.2.1.2 對照品溶液的配制 三硝基苯磺酸TNBS溶液25 g/L：取50 g/L的三硝基苯磺酸溶液(TNBS)與50%乙醇以體積1∶1配成25 g/L的混合液。

1.2.1.3 抗原乳化液的制備 刮取新西蘭兔結(jié)腸粘膜制成組織勻漿，以3000 r/min速度離心30 min，取上清液提純，根據(jù)蛋白含量調(diào)整稀釋倍數(shù)，檢測蛋白含量約為20 g/L，與等量完全弗氏佐劑混合配成抗原乳化液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 動物免疫方法 模型組大鼠全部于第1天、第14天在大鼠頸、背部皮下注射抗原乳化液(體積為0.8 mL/只動物，含抗原8 mg)，為了抗原吸收充分，注射時(shí)選取不同部位，分3～4點(diǎn)注射。第22天，所有大鼠禁食不禁水24 h，第23天，造模組大鼠TNBS灌腸。

1.2.1.5 TNBS灌腸方法 大鼠乙醚麻醉，將一直徑2.0 mm、長約12 cm的塑膠管由肛門輕緩插入大鼠體內(nèi)深約8 cm，按照TNBS 75 mg/kg的劑量，0.3 mL/100 g體重的給藥體積緩慢注入含25 g/L 的TNBS乙醇溶液。然后注入約0.1 mL的空氣，將留在塑膠管內(nèi)的藥物排入腸內(nèi)。給藥完畢，緩慢拔出塑膠管，用手捏住肛門，提起大鼠尾部，持續(xù)倒置1 min，使造模劑充分滲入大鼠腸腔內(nèi)。

1.2.1.6 動物每組10只，5只/大箱，分4箱。每組第1箱5只連續(xù)觀察14天，每組第2箱5只連續(xù)觀察7天，分別于結(jié)束后按造模后處置方法處理。

1.2.1.7 造模后處置方法 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血(不抗凝)，室溫放置約30 min，3000 r/min離心10 min，取上清-80℃保存待檢測。放血處死大鼠，解剖，沿結(jié)腸腸系膜縱軸剪開，生理鹽水沖洗，觀察結(jié)腸變化，進(jìn)行腸黏膜損傷CMDI評分。截取自肛門向上約10 cm肉眼觀察病變明顯的結(jié)腸段中性甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.2 觀察大鼠一般情況 體質(zhì)量、大便性狀、便血率.

1.2.3 腸黏膜形態(tài)及病理學(xué)檢查：戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血(不抗凝)，室溫放置約30 min，3000 r/min離心10min，取上清-80℃保存待檢測。放血處死大鼠，解剖，沿結(jié)腸腸系膜縱軸剪開，生理鹽水沖洗，觀察結(jié)腸變化。截取自肛門向上約10cm肉眼觀察病變明顯的結(jié)腸段中性甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.4 CMDI評分 進(jìn)行腸黏膜損傷CMDI評分，見表1。

表1 CMDI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 白介素(interleukin，IL)-10水平測定 用ELISA法測定血漿含量，操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 免疫期間，模型組動物頸、背部注射抗原乳化液部位逐漸發(fā)現(xiàn)皮下有小的硬塊，考慮為抗原乳化液吸收不完全所致。TNBS灌腸造模后全部動物會陰部暗紅色污穢，排稀便、血便，約4 d后已觀察不到明顯的血便，部分動物會陰部污穢和稀便癥狀開始逐日減輕直至消失。直至14 d給藥期結(jié)束，模型組仍有兩只動物排稀便，其余動物除發(fā)現(xiàn)會陰部少量污穢外，其余未見明顯異常。正常對照A組動物整個(gè)試驗(yàn)期間未見異常。

造模期體重(見表2)：與正常對照A組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)的體重均有降低，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表2 UC模型大鼠給藥期的體重

2.2 大便的性狀評分 7天組：與正常對照A組相比，模型對照B組的大便性狀評分較高(P<0.01)14天組：與正常對照A組相比，模型對照B組的大便性狀評分較高(P<0.01)。

2.2 便血程度評分 肉眼觀察各組大鼠糞便均未見到模型血便，OB試卡檢測大便的隱血情況均為陰性，評分均為0，該指標(biāo)未做組間統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 CMDI評分(見表3) 7天組：與正常對照A組相比，模型對照B組的CMDI評分較高(P<0.01)。14天組：與正常對照A組相比，模型對照B組的CMDI評分較高(P<0.01)。

表3 各組大鼠的CMDI評分評分

注：與正常對照A組比較，**P<0.01

2.4 IL-10(見表4) 7天組：與正常對照A組相比，模型對照B組的IL-10水平較低(P<0.05)；14天組：與正常對照A組相比，模型對照B組的IL-10水平較低(P<0.05)。

表4 各組大鼠的血清學(xué)指標(biāo)

注：與正常對照A組比較，*P<0.05

3 討論

TNBS誘導(dǎo)模型，屬于免疫致敏模型，其機(jī)制是乙醇破壞腸黏膜屏障后，TNBS與腸組織蛋白結(jié)合形成完全抗原，導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，從而造成腸黏膜的損傷。TNBS-乙醇模型在是國內(nèi)外比較公認(rèn)的UC模型，也是應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)UC模型。該模型慢性炎癥表現(xiàn)突出，且病程維持時(shí)間較長，價(jià)格低廉，為研究炎癥慢性化的原因和探索新的治療藥物創(chuàng)造了條件，且該模型病變組織學(xué)改變與人類炎癥性腸病相似。免疫復(fù)合物加TNBS-乙醇模型此模型是結(jié)腸黏膜組織致敏模型和TNBS-乙醇模型的結(jié)合運(yùn)用，使機(jī)體發(fā)生全身免疫異常與局部炎癥病變共存，得到與人UC較為相近的實(shí)驗(yàn)動物模型。吳玉泓等研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合大鼠UC模型大鼠結(jié)腸組織MDA、NO、TNOS及iNOS含量升高，SOD、GSH-Px水平顯著降低。模型組血清和結(jié)腸IL-4含量較對照組明顯降低，而模型大鼠血清和結(jié)腸TNF-α含量明顯升高，模型組大鼠血清IFN-γ含量明顯升高。結(jié)論顯示，該方法可以較好的模擬人類UC病變的慢性活動性特點(diǎn)，完全可以運(yùn)用于臨床藥物評價(jià)[2]。

UC病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，目前認(rèn)為可能與遺傳、免疫、感染、飲食、環(huán)境及心理因素有關(guān)，其中免疫為UC發(fā)病的重要因素，特別是細(xì)胞因子發(fā)病機(jī)制越來越受到人們的重視。而促炎性細(xì)胞因子與抑炎性細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)所致免疫異常，被視為UC的重要發(fā)病機(jī)制[1]。IL-10等炎癥細(xì)胞因子被認(rèn)為能介導(dǎo)UC發(fā)病[3]。IL-10 又名細(xì)胞因子合成抑制因子，是由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生的多效性抑制炎癥性細(xì)胞因子[4]，它的主要生物學(xué)功能是抑制炎癥反應(yīng)和抑制促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-8、IL-1β)的釋放，調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的增殖和分化[5]。王燕林UC通過研究發(fā)現(xiàn)患者血清IL-10水平增高，且與UC的病情嚴(yán)重程度有關(guān)[6]。

本研究結(jié)果表明：UC模型大鼠體重減輕，體重增長緩慢(P>0.05)。大便的性狀評分、CMDI評分均升高(P<0.01)。血清IL-10水平降低(P<0.05)。故本模型具有成功率高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，且模型的病變機(jī)制與人類UC相符，是較理想的UC動物模型，其缺點(diǎn)是模型制備稍繁瑣、時(shí)間較長。此外，根據(jù)文獻(xiàn)大鼠的左、右側(cè)足跖注射抗原乳化液，在預(yù)試驗(yàn)過程中出現(xiàn)局部壞死，故改為頸、背部皮下注射。

[1]翁一潔，江丹賢.不同大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的比較與探討[J].臨床與醫(yī)療，2009，(5)：779-780.

[2]吳玉泓，李海龍，段永強(qiáng).免疫致敏結(jié)合局部乙酸刺激法建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2010，18(1)：65-68.

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An Experimental Study of Immune Complexes Ulcerative Colitis Rat Model

KANG Yi-bing1，LV Yong-hui1，WU Yu-jin1，ZHONG Zhi-yong2，WU Xin2

(1.TraditionalChineseMedicineHospitalofGuangzhouCity，Guangzhou510000，Guangdong；2.GuangdongMedicalExperimentalAnimalCenter，Guangzhou510000，Guangdong)

Objective：To establish immune complexes ulcerative colitis rats model and explore its application value.Methods：20 SD rats were randomly divided into a normal control group and a model group，10 rats per group.The necks and backs of the model rats were given subcutaneous injection of antigen emulsion，and in the 23rd day these rats were given TNBS enema while the control group was given saline enema.The fecal traits，fecal blood and weight loss of each group was compared and observed histologically.Results：The weight loss of UC model rats gained slowly(P>0.05).Serum IL 10 reduced(P<0.05).Both fecal trait scores and CMDI rates increased(P<0.01).Conclusion：The immune complex ulcerative colitis rat models are made highly successfully with good repeatablilty，and the model disease mechanism is consistent with human’s UC model，an ideal animal ulcerative colitis model.

ulcerative colitis，rat，animal model

2012年廣東省中醫(yī)藥局課題(NO：20121035)；2013年廣州市衛(wèi)生局課題(NO：20131A011033)

康宜兵(1975.5-)，男，副主任中醫(yī)師，碩士學(xué)位，主要從事的中醫(yī)消化專業(yè)臨床工作，研究方向：脾胃及肝膽疾病的中醫(yī)診治。E-mail：kangyibing@126.com

R285

A

1007-2349(2015)10-0055-03

2015-08-17)