陸勝利， 祁 超

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系， 安徽 安慶 246052； 2.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430079)

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海洋放線菌代謝產(chǎn)物、非核糖體多肽、腺苷化結(jié)構(gòu)域研究進(jìn)展

陸勝利1， 祁 超2*

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系， 安徽 安慶 246052； 2.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430079)

概述了海洋放線菌代謝產(chǎn)物、非核糖體多肽、腺苷化結(jié)構(gòu)域的研究進(jìn)展.

海洋放線菌; 代謝產(chǎn)物; 腺苷化結(jié)構(gòu)域

1 放線菌概述

放線菌是一類主要呈菌絲狀生長(zhǎng)和以孢子繁殖的高(G+C)%革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，屬厚壁菌門、放線細(xì)菌綱.土壤中的放線菌在死去動(dòng)植物降解和腐殖質(zhì)形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們能利用諸如角質(zhì)素、木質(zhì)纖維素和幾丁質(zhì)這類不易降解的多聚物作為營(yíng)養(yǎng)物來(lái)源，使自然界生物物質(zhì)的再循環(huán)得以實(shí)現(xiàn).

放線菌具有豐富的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)多樣性，在自然界的分布十分廣泛，主要以孢子或菌絲狀態(tài)存在于土壤、空氣和水中，尤其是在含水量低、有機(jī)物豐富、呈中性或微堿性的土壤中數(shù)量最多，可達(dá)105～106個(gè)/克，土壤特有的泥腥味也是因放線菌產(chǎn)生的土腥味素所致.放線菌目可分為10個(gè)亞類，其代表菌屬主要有鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、放線菌屬(Actinomyces)、小單孢菌屬(Micromonospora)、孢囊鏈菌屬(Streptosporangium)和游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)等(見(jiàn)圖1).

放線菌與人類的生產(chǎn)、生活有著極為密切的關(guān)系，其天然代謝產(chǎn)物一直是現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中藥物先導(dǎo)化合物的一個(gè)主要來(lái)源.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的大約23 000種微生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物中，45%以上(超過(guò)10 000種)都來(lái)自放線菌家族，這其中包括了約70%的已知抗生素[1].藥物研發(fā)中，既直接提取放線菌的天然活性產(chǎn)物作藥物成分，也以其作為母體或模板進(jìn)行化學(xué)修飾合成或全合成.

圖1 放線菌的代表菌屬

2 海洋放線菌的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)

近些年來(lái)，日益加劇的病原微生物耐藥性以及傳統(tǒng)土壤來(lái)源材料中已知放線菌和抗生素的大量重復(fù)分離，都極大地阻礙了人們尋求新型有效生物活性物質(zhì)的進(jìn)程[2].于是，微生物天然產(chǎn)物的分離范圍逐步從陸地移向了海洋.占據(jù)地球總面積約70%的海洋，無(wú)論是從微生物數(shù)量還是從多樣性上都比陸地生境具有更為廣闊的研究前景，因此如何去開(kāi)發(fā)海洋環(huán)境中的微生物資源就成了人們空前關(guān)注的熱點(diǎn).

但海洋放線菌的種群起源問(wèn)題，一直以來(lái)都備受爭(zhēng)議，學(xué)者們十分關(guān)心是否有真正意義上的海洋專屬放線菌存在.一些人認(rèn)為海洋與陸地直接相連、有著密不可分的聯(lián)系，陸生放線菌尤其是厚壁菌門釋放的抗性孢子可以隨河流沖刷入海并在休眠狀態(tài)下保持多年的繁殖發(fā)育潛力，因此他們懷疑從海洋中發(fā)現(xiàn)的放線菌均來(lái)自陸地，是被不斷沖刷而最終隨河流匯入大海的[3].另有學(xué)者報(bào)道，距離陸地越近的海域里海洋放線菌越多而遠(yuǎn)海中的海洋放線菌則相對(duì)較少，這也間接支持了海洋放線菌是起源于陸地的說(shuō)法[4].

另一方面，也有不少科學(xué)家堅(jiān)持相信海洋中必定有專屬的土著放線菌類群存在，他們一直鍥而不舍地進(jìn)行著海洋來(lái)源放線菌的分離和研究，以期望早日找到支持自己觀點(diǎn)的確鑿證據(jù).海洋放線菌的采樣最早起始于20世紀(jì)60年代末期[5].1984年，Helmke等首次對(duì)海生紅球菌Rhodococcusmarinonascenssp. nov.進(jìn)行了系統(tǒng)的分類學(xué)形態(tài)特征描述[6].隨后，F(xiàn)enical小組在1991年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)依賴海水生長(zhǎng)的特殊放線菌家族“MAR1”(后稱之為“Salinispora”)，只有在培養(yǎng)基中添加海水或特定鈉鹽后該菌屬菌株才能保持正常的生長(zhǎng)[7].這些由傳統(tǒng)分類學(xué)方法(主要是形態(tài)學(xué)特征分析)描述過(guò)的海洋來(lái)源放線菌，在一定程度上預(yù)示了海洋專一性放線菌存在的可能性，但由于缺乏基因型和進(jìn)化關(guān)系等分子水平上的有力證據(jù)，海洋放線菌的研究在當(dāng)時(shí)仍得不到廣泛的認(rèn)可.直到2002年，即在DNA測(cè)序技術(shù)逐步成熟時(shí)，F(xiàn)enical小組對(duì)“MAR1”菌屬進(jìn)行了16S rRNA序列分析，結(jié)果表明該菌屬屬于小單孢菌科，但在基因型和進(jìn)化關(guān)系上卻明顯獨(dú)樹(shù)一幟，不在相應(yīng)陸生放線菌的范圍之內(nèi)[8].到2005年，在結(jié)合了全面的形態(tài)學(xué)特征分型和基因組測(cè)序分析之后，“MAR1”最終被該小組鑒定為第一個(gè)確鑿的固有海洋性放線菌屬，并正式更名為“Salinispora”[9]；這一發(fā)現(xiàn)無(wú)疑成為海洋放線菌和天然產(chǎn)物研究史上的一座重要里程碑，其深遠(yuǎn)意義不言而喻.自此，海洋放線菌的研究受到了極大的鼓舞和肯定，越來(lái)越多的海洋放線菌被分離和鑒定，為海洋放線菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供了必要的基礎(chǔ).

3 海洋放線菌的分布和種屬

海洋放線菌的分布極其廣泛，來(lái)源也豐富多樣，主要包括上層海水[10]、不同地域的淺水或深水沉積物[11-12]、海綿以及海藻[13]等.目前，已從不同來(lái)源的海洋棲息環(huán)境中分離到近20個(gè)屬的固有海洋性放線菌，現(xiàn)歸納整理如表1[14].

表1 海洋放線菌新種屬

續(xù)表1

4 海洋放線菌的生物活性天然產(chǎn)物

海洋放線菌與陸生放線菌在生理學(xué)和種系發(fā)育上存在顯著差異.它們?cè)谔厥夂Ｑ笊姝h(huán)境(高鹽、高壓、低溫、低光照和寡營(yíng)養(yǎng)等)的選擇壓力下，可調(diào)整自身次級(jí)代謝途徑并積累一些結(jié)構(gòu)和活性都明顯不同于陸生放線菌的新穎代謝產(chǎn)物；這些陸生微生物所不具備的潛在優(yōu)勢(shì)，使海洋放線菌成為未來(lái)新天然藥物開(kāi)發(fā)的一大資源寶庫(kù)[13-14].

目前，人們已經(jīng)從海洋放線菌發(fā)酵培養(yǎng)液中檢測(cè)到各類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、活性多樣的新穎代謝產(chǎn)物，主要包括聚酮、多肽、雜合聚酮-多肽、大環(huán)內(nèi)酯、萜類、醌類和生物堿等.其中，不少化合物都是潛在的有效抗菌劑和抗癌劑，如salinisporamides[15]、abyssomicins[16]和 proximicins[17]等，這為藥物先導(dǎo)化合物的篩選提供了寶貴新來(lái)源(表2)[13，18].

表2 海洋放線菌來(lái)源的天然產(chǎn)物及其生物活性

5 海洋專性放線菌屬Salinispora及其潛在藥用天然產(chǎn)物

5.1Salinispora菌屬

Salinispora菌屬是第一個(gè)被報(bào)道(1991年)和確證(2005年)的專屬海洋放線菌，它的發(fā)現(xiàn)為海洋微生物和天然產(chǎn)物研究開(kāi)辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域.本屬菌株最早于1991年由Fenical小組從巴哈馬群島海岸附近的熱帶近海沉積物中分離獲得(當(dāng)時(shí)命名為“MAR1”)，后又從來(lái)自大西洋、紅海、科特斯海等全球范圍內(nèi)的熱帶和亞熱帶近海沉積物中得到穩(wěn)定分離，這表明該屬放線菌具有廣泛的世界性分布[6-7].

Salinispora菌屬屬于小單孢菌科(Micromonosporaceae)，但與以往的該科陸生放線菌在表型和基因型上都存在明顯差異.2005年，F(xiàn)enical小組正式鑒定Salinispora為第一個(gè)海洋專一性放線菌屬，并對(duì)其形態(tài)學(xué)、化學(xué)和基因組學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)而概括的分類學(xué)描述[8].

Salinispora是一類不耐酸、好氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，存在于近海岸線或深至2 000 m的海洋沉積物中，也以共生菌的形式存在于海草和藻類中；具有類似相應(yīng)陸生放線菌的功能，參與海底有機(jī)物質(zhì)的降解[19].Salinispora能形成不間斷的分支菌絲，直徑在0.25～0.5 μm之間(見(jiàn)圖2 A)；其細(xì)胞壁肽聚糖中含有N-羥乙?；陌谒岷蛢?nèi)消旋-二氨基庚二酸，菌體內(nèi)不含分枝菌酸,但含飽和脂肪酸；利用的糖源主要為半乳糖、阿拉伯糖和木糖.Salinispora的一般生長(zhǎng)條件為：pH 7～12、溫度10～30 ℃；它最大的特點(diǎn)是只有向培養(yǎng)基中添加了海水或特定濃度的鈉鹽時(shí)才能維持正常生長(zhǎng).在Salinispora的短孢子梗上，通常長(zhǎng)有直徑為0.8～3.8 μm的孢子，它們?cè)谂囵B(yǎng)菌落上形成一些灰黑色的區(qū)域；這些孢子外觀光滑、無(wú)法運(yùn)動(dòng)，可單個(gè)或成簇產(chǎn)生.當(dāng)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)足夠豐富時(shí)，Salinispora形成無(wú)氣生菌絲的橙色或黑色菌落；營(yíng)養(yǎng)供給貧瘠時(shí)，則形成菌絲體并產(chǎn)生可擴(kuò)散的橙色、粉紅、深褐色或黑色色素[6-7](見(jiàn)圖2 B).

圖2 Salinispora的各種形態(tài)

目前，根據(jù)16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，將Salinispora菌屬分成3大類菌種：Salinisporaarenicola、Salinisporatropica和Salinisporapacifica.Salinisporaarenicola(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為S.arenicola)存在于關(guān)島、紅海、巴哈馬群島、帕勞、科特斯海和美國(guó)維爾京群島等地的熱帶或亞熱帶海域沉積物中，它具有十分廣泛的世界性分布；最佳生長(zhǎng)條件為20～28℃和25%～50%的海水，主要能源物質(zhì)為L(zhǎng)-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、熊果苷和D-水楊苷[8，19-20].相比之下，Salinisporatropica(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為S.tropica)的分布范圍則較窄，目前只在巴哈馬群島的熱帶海域沉積物中發(fā)現(xiàn)過(guò)該菌種；其最佳生長(zhǎng)溫度為15～28℃，以菊粉和半乳糖作為碳源[8，20].Salinisporapacifica(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為S.pacifica)目前在還處在進(jìn)一步的分類學(xué)研究中，已經(jīng)從帕勞、紅海、關(guān)島、大堡礁和斐濟(jì)群島等地的海域中分離出該菌種[19].

5.2Salinispora屬放線菌的潛在藥用天然產(chǎn)物

Salinispora自2005年被鑒定以來(lái)，一直受到科研工作者們的密切關(guān)注，現(xiàn)已陸續(xù)從其發(fā)酵培養(yǎng)液中分離出多種化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)(見(jiàn)圖3)；這些次級(jí)代謝產(chǎn)物大多具有抗癌、抗菌、抗病毒或抗炎癥活性，是潛在的藥物先導(dǎo)化合物來(lái)源(見(jiàn)表3)[20].其中，salinosporamide A是目前最引人注目的Salinispora天然產(chǎn)物之一，它作為一種極為有效的蛋白酶抑制劑，已經(jīng)進(jìn)入治療癌癥的臨床試驗(yàn)階段[21].

研究表明，Salinispora屬放線菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有菌種特異性，即S.arenicola、S.tropica和S.pacifica這3個(gè)菌種的次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)型是不重疊的；這里，用于區(qū)分不同菌種的依據(jù)是16S rRNA基因進(jìn)化關(guān)系，而不再是傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn).這一發(fā)現(xiàn)暗示Salinispora的種系型特異代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與其適應(yīng)特定外界生存環(huán)境有關(guān)；據(jù)此，可利用該屬放線菌的種系型和次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)型之間的特異性對(duì)應(yīng)關(guān)系，去挖掘和發(fā)現(xiàn)更多的新天然活性產(chǎn)物，在一定程度上避免化合物的重復(fù)篩選[22].

表3 Salinispora屬放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物和生物學(xué)活性

圖3 Salinispora屬放線菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

6 非核糖體多肽(NRP)

6.1 多肽類天然產(chǎn)物

作為天然產(chǎn)物中排名緊跟聚酮之后的第二大家族，多肽類活性物質(zhì)一直備受人們關(guān)注.根據(jù)它在生物體內(nèi)的合成方式，可將其分為兩大類：一類是經(jīng)核糖體途徑產(chǎn)生，例如，硫醚抗生素乳酸鏈球菌肽和枯草菌素是由核糖體合成前體多肽后經(jīng)翻譯后修飾和蛋白酶解加工而成[23]；而另一類活性多肽在合成過(guò)程中則完全不依賴于常見(jiàn)的蛋白質(zhì)核糖體合成系統(tǒng)、占據(jù)著制藥業(yè)中更為重要的地位，統(tǒng)稱為非核糖體多肽(NRPs；nonribosomal peptides)，例如，谷胱甘肽和細(xì)菌細(xì)胞壁前體二肽DAla-DAla由酶催化的磷酸化作用組裝而來(lái)[24]，短桿菌酪肽(tyrocidine)由短桿菌酪肽合酶(tyrocidine synthetases)合成.

6.2 非核糖體多肽及其多樣性

NRPs是一大類在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性上都具有多樣性的重要多肽類天然產(chǎn)物(見(jiàn)圖4和圖5)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中.與核糖體系統(tǒng)合成產(chǎn)物不同，NRP組分中不僅包含20種基本的蛋白質(zhì)源氨基酸，還含有大量的稀有氨基酸，如D-氨基酸、α-羥酸、N-/O-甲基氨基酸等；而結(jié)構(gòu)上，NRP分子經(jīng)常呈完整的大環(huán)狀或雜環(huán)狀，側(cè)鏈還被糖基化、磷酸化、?；茸饔眯揎梉25].這些獨(dú)有特征賦予NRPs復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而表現(xiàn)出豐富的生物學(xué)活性，可概括如下[25-27]：①抗生素：青霉素(penicillins)前體ACV、萬(wàn)古霉素(vancomycin)、桿菌肽(bacitracin)、短桿菌肽(gramicidin)；②鐵載體：分枝菌素(mycobactin)、腸菌素(enterobactin)；③毒素：丁香霉素(syringomycin)、煙曲霉毒素(gliotoxin)、HC-toxin；④免疫抑制劑：雷帕霉素(rapamycin)、環(huán)孢霉素(cyclosporin)；⑤生物表面活性劑：surfactin A；⑥抗腫瘤：博萊霉素(bleomycin)以及⑦激素、抗真菌、抗病毒等.

圖4 陸地環(huán)境來(lái)源的NRPs

圖5 海洋環(huán)境來(lái)源的NRPs

7 非核糖體多肽合酶(NRPS)

7.1 非核糖體多肽合酶的結(jié)構(gòu)與功能

非核糖體多肽合酶(NRPSs；nonribosomal peptide synthetases)是一類大的多酶復(fù)合物，負(fù)責(zé)非核糖體多肽的生物合成.對(duì)大多數(shù)真菌非核糖體多肽合酶而言，合成某種特定多肽產(chǎn)物的NRPS是一個(gè)單條多肽鏈，如1 600 000的環(huán)孢霉素合酶[28](cyclosporin synthetases)；而大多數(shù)原核細(xì)菌的非核糖體多肽合酶則由一些相互作用的亞基組成，每個(gè)亞基又單獨(dú)稱作NRPS，如短桿菌酪肽合酶[29](tyrocidine synthetases)由3個(gè)相互作用的亞基組成，分別稱為短桿菌酪肽合酶TyrA、TyrB、TyrC.

NRPSs由一系列被稱作“模塊(module)”的重復(fù)催化單位和結(jié)構(gòu)單位組成，一個(gè)完整的NRPS通常包含3～15個(gè)模塊，每個(gè)模塊負(fù)責(zé)完成肽鏈延伸的一輪循環(huán)反應(yīng)，將單個(gè)相應(yīng)的氨基酸組成單元摻入到非核糖體多肽產(chǎn)物組裝線的對(duì)應(yīng)位置上.特別的是，每個(gè)模塊只有以結(jié)合上輔因子P-pant(磷酸泛酰巰基乙胺)后的完整形式存在時(shí)，才能發(fā)揮出其催化活性；輔因子P-pant是非核糖體多肽合酶被翻譯后由4’-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶一起添加到所有模塊上的.NRPS的每個(gè)模塊又進(jìn)一步被劃分為幾個(gè)“結(jié)構(gòu)域(domain)”，它們催化單個(gè)生化反應(yīng)步驟，如活化、共價(jià)連接、摻入單體底物的選擇性修飾、酰胺鍵形成和多肽產(chǎn)物釋放等(圖6).

圖6 非核糖體多肽合酶的組織結(jié)構(gòu)

一個(gè)最小的NRPS鏈延伸模塊包括3個(gè)核心的結(jié)構(gòu)域：氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域(A domain；adenylation domain)、肽酰載體蛋白結(jié)構(gòu)域(PCP domain；peptidyl carrier protein domain；也叫硫酯結(jié)構(gòu)域，T domain)和縮合結(jié)構(gòu)域(C domain；condensation domain).它們催化的一輪鏈延伸循環(huán)反應(yīng)包括以下3個(gè)步驟[25](圖7)：① 首先，A結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合一個(gè)氨基酸底物，在ATP消耗下催化相應(yīng)“氨酰-AMP”的形成；② 接著，已激活的氨酰-AMP連接到PCP結(jié)構(gòu)域的輔因子Ppant(4’-磷酸泛酰巰基乙胺)的空載巰基上，形成“氨酰-S-PCP”復(fù)合物；③ 最后，C結(jié)構(gòu)催化肽鏈的延伸.分別攜帶有氨?；碗孽；妮d體(第一個(gè)肽鍵時(shí)是兩個(gè)帶有氨?；妮d體)與C結(jié)構(gòu)域上的特定區(qū)域(受體位點(diǎn)a & 供體位點(diǎn)d)結(jié)合，氨酰-S-載體復(fù)合物上的氨基向肽酰-S-載體復(fù)合物上肽?；孽；M(jìn)行親核攻擊，形成新肽鍵，進(jìn)而產(chǎn)生延長(zhǎng)了一個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的新的肽酰-S-載體復(fù)合物和游離的載體[30].

圖7 肽鏈延伸的一輪循環(huán)反應(yīng)(由單個(gè)NRPS模塊完成)

7.2 非核糖體多肽合酶的類型和研究意義

根據(jù)NRP組裝時(shí)NRPSs所采用的不同生物合成策略，可將其分為3類：線性NRPSs(A型)、迭代型NRPSs(B型)、非線性NRPSs(C型).線性NRPSs(A型)中，3個(gè)核心結(jié)構(gòu)域以C-A-PCP的順序在延伸模塊上排列，即一個(gè)合成含n個(gè)氨基酸殘基的多肽的線性NRPS蛋白質(zhì)模板由結(jié)構(gòu)域以A-PCP-(C-A-PCP)n-1-Te順序排列的n個(gè)模塊組成.另一方面，NRPs的合成方向是從N端到C端，故A型NRPS模塊的數(shù)量、種類、排列順序決定了多肽產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)，二者成線性關(guān)系.與線性NRPSs(A型)相比，迭代型NRPSs(B型)的特點(diǎn)是在多肽合成過(guò)程中多次使用它們的模塊或結(jié)構(gòu)域；而非線性NRPSs(C型)的核心結(jié)構(gòu)域C、A、T中至少有一個(gè)異常排列，其模塊數(shù)與多肽產(chǎn)物的氨基酸殘基數(shù)無(wú)線性對(duì)應(yīng)關(guān)系[31].

顯然，NRPSs的模塊構(gòu)造特征為發(fā)展NRP組合生物合成技術(shù)提供了一個(gè)有力的機(jī)會(huì)，我們可以通過(guò)人工操控NRP生物合成途徑中的特定基因(如結(jié)構(gòu)域或模塊的互換)來(lái)預(yù)測(cè)和生產(chǎn)具有新的生物學(xué)活性的雜合多肽，為抗生素新藥研究和開(kāi)發(fā)奠定良好基礎(chǔ).

8 腺苷化酶超家族與NRPS氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域

8.1 腺苷化酶超家族

腺苷化酶超家族(adenylating enzyme superfamily)是指一類在ATP消耗下將特定羧酸底物激活而生成相應(yīng)“?；?AMP”的酶類的總稱，它們?cè)谠松锖驼婧松锏拇x途徑中均發(fā)揮極其重要而多樣化的作用，參與核糖體途徑和非核糖體途徑多肽合成、脂肪酸氧化和合成、酶類調(diào)節(jié)等一系列代謝過(guò)程.這類酶都能催化以下兩步特征性反應(yīng)：①結(jié)合特異性羧酸底物，與ATP縮合形成有反應(yīng)活性的腺苷化底物并生成焦磷酸(PPi)；②活化的腺苷化底物與親核試劑反應(yīng)，釋放出終產(chǎn)物和AMP.

根據(jù)氨基酸序列同源性和識(shí)別底物特異性，將腺苷化酶超家族分成3大類：NAL家族、氨酰-tRNA合酶和NIS(非NRPS依賴的鐵載體合酶).其中，NAL家族又由酰基/芳基輔酶A合成酶、熒光素氧化酶和NRPS氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域(NRPS A domain)組成[32].NAL家族的最大特點(diǎn)是其成員在空間結(jié)構(gòu)上具有高度一致的同源性：他們都折疊成一個(gè)較大的N-末端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較小的C-末端結(jié)構(gòu)域，中間則由一段柔性鉸鏈連接；而酶的活性中心通常正位于N-、C-這兩個(gè)相鄰折疊結(jié)構(gòu)域的交界處，因此酶結(jié)合底物后N-、C-兩個(gè)折疊結(jié)構(gòu)域之間的相對(duì)空間定向也會(huì)隨之改變[33-35].目前，已有許多腺苷化酶家族成員的晶體結(jié)構(gòu)得到解析，如螢火蟲(chóng)熒光素酶[34]、短桿菌肽合酶的PheA[35]、Bacillibactin合酶的DhbE[36]、乙酰輔酶A合酶[37]、4’-葉綠素苯甲酸酯:CoA合酶[38]等.

8.2 NRPS氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域(NRPS A domain)

NRPS氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域(NRPS A domain，簡(jiǎn)稱A結(jié)構(gòu)域)是“腺苷化酶超家族”的一員，平均大小約為550個(gè)氨基酸殘基，在NRP生物合成途徑中起兩方面的作用：①選擇和激活特異性氨基酸底物，如圖8(A)所示；②轉(zhuǎn)移活化的氨酰-AMP到下游T結(jié)構(gòu)域的Ppant上，如圖8(B)所示.由此可見(jiàn)，NRPS A domain在NRP生物合成中占據(jù)著重要的地位，它決定了NRP終產(chǎn)物的成分組成和結(jié)構(gòu)多樣性.

圖8 NRPS A domain催化的反應(yīng)

A結(jié)構(gòu)域的底物特異性與空間結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)，一直是相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家們的研究熱點(diǎn).第一個(gè)得到晶體結(jié)構(gòu)解析的A結(jié)構(gòu)域 —— 短桿菌肽合酶(gramicidin synthetase)中的PheA，于1997年由德國(guó)科學(xué)家Mohamed A Marahiel帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)率先完成[35](圖9).基于此晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究成果，Mohamed A Marahiel等科學(xué)家將PheA和DhbE活性位點(diǎn)處的氨基酸殘基序列與其他底物特異性已知的NRPS A結(jié)構(gòu)域的對(duì)應(yīng)位置上的氨基酸殘基序列進(jìn)行比對(duì)分析和進(jìn)化樹(shù)分析，確定了由底物結(jié)合口袋中的10個(gè)氨基酸殘基依次排列組成的序列標(biāo)簽，他們將其稱作非核糖體多肽生物合成的“底物特異性賦予的密碼子”[39].在核糖體合成體系中，3個(gè)堿基決定1個(gè)核糖體多肽合成的密碼子，而NRPS合成體系中則是由其NRPS A結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽的10個(gè)氨基酸殘基的序列特性來(lái)決定1個(gè)NRP密碼子.因此，只需通過(guò)生物信息學(xué)方法分析NRPS A結(jié)構(gòu)域的一級(jí)氨基酸序列，就可以使用以上NRP密碼子規(guī)律，在酶活性測(cè)定之前預(yù)測(cè)一些未知NRPS A結(jié)構(gòu)域的特異性底物.Challis等將已通過(guò)實(shí)驗(yàn)和其它途徑確定的NRPS A結(jié)構(gòu)域有關(guān)信息收集整理起來(lái)，建立了其氨基酸底物識(shí)別特異性的數(shù)據(jù)庫(kù)，可通過(guò)相關(guān)網(wǎng)址進(jìn)行查尋(http://raynam.chm.jhu.edu)，這極大地方便了NRPS A結(jié)構(gòu)域底物特異性的研究和預(yù)測(cè)[40].

圖9 短桿菌肽合酶中PheA的晶體結(jié)構(gòu)示意圖

通常，A結(jié)構(gòu)域具有高度的底物特異性；然而也發(fā)現(xiàn)有一些底物特異性較寬松的天然A結(jié)構(gòu)域存在[41]，它們?cè)诮M合生物合成上具有重大利用價(jià)值，是創(chuàng)造非天然合成途徑的潛在試劑和工具，能用于產(chǎn)生新的藥物先導(dǎo)化合物.然而，分析A結(jié)構(gòu)域酶活性的傳統(tǒng)經(jīng)典方法是測(cè)定具有放射性的ATP-[32P]PPi交換反應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù).這種方法不利于從大批量測(cè)試對(duì)象中篩選出個(gè)別具有較低底物特異性的A結(jié)構(gòu)域，因?yàn)槭澜缟洗蟛糠謱?shí)驗(yàn)室都不具備處理高通量放射性物質(zhì)的能力.2009年Thomas J. McQuade等報(bào)到了一種便捷而非放射性的高通量確定A結(jié)構(gòu)域酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的比色測(cè)定法[42].他們?cè)贏結(jié)構(gòu)域催化氨酰-AMP形成的反應(yīng)體系中添加無(wú)機(jī)焦磷酸酶和孔雀石綠染料，這樣由A結(jié)構(gòu)域作用于ATP和底物后釋放出的焦磷酸就會(huì)分解成正磷酸Pi，孔雀石綠染料能和產(chǎn)生正磷酸Pi結(jié)合并在620 nm處有最大光吸收，故最后只需測(cè)定正磷酸的濃度即反應(yīng)產(chǎn)物的OD620值就可獲得A結(jié)構(gòu)域的各項(xiàng)酶學(xué)參數(shù).該比色測(cè)定法準(zhǔn)確可靠而定量，可在96或384孔板中進(jìn)行.這項(xiàng)工作為大批量篩選和鑒定A結(jié)構(gòu)域突變體提供了一個(gè)有力的工具，極大地推動(dòng)了A結(jié)構(gòu)域在NRP組合生物合成學(xué)上的應(yīng)用和新NRP先導(dǎo)化合物的探索研究.

我們課題組正在開(kāi)展海洋放線菌的相關(guān)研究，在cDNA文庫(kù)構(gòu)建、調(diào)控因子、A結(jié)構(gòu)域取得了一些初步進(jìn)展[43-48].

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Progress of Metabolites，NRP and adenylation domain from marine actinomycete

LU Shengli1， QI Chao2

(1.Department of Medical， Anqing Medical College， Anqing， Anhui 246052;2.Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology， College of Life Sciences，Central China Normal University， Wuhan 430079)

Metabolites nonribosomal peptide synthetases and Adenylation domain of Marine actinomycete were summarized．

marine actinomycete; metabolites; adenylation domain

2014-01-20.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20772040)；教育部中央高校自主研究項(xiàng)目(CCNU14F01006).

1000-1190(2015)01-0114-11

Q936

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: qichao@mail.ccnu.edu.cn.