西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710061)

廉民學(xué) 馮鴻飛△ 姜海濤 梁 晨 郭世文▲

8-OHdG在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達及意義*

△陜西省洛南縣醫(yī)院神經(jīng)外科

▲通訊作者

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710061)

廉民學(xué) 馮鴻飛△姜海濤 梁 晨 郭世文▲

目的：探討8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達及其意義。方法：采用免疫組化SP法檢測45例不同級別膠質(zhì)瘤組織中8-OHdG的表達，并結(jié)合臨床資料分析其與膠質(zhì)瘤臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果：DNA氧化性損傷標志物8-OHdG在高級別(Ⅲ～Ⅳ級)膠質(zhì)瘤中的表達強于低級別(Ⅰ～Ⅱ級)膠質(zhì)瘤，在不同性別、年齡的膠質(zhì)瘤患者中8-OHdG的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：高級別膠質(zhì)瘤組織中的DNA氧化性損傷較低級別嚴重，8-OHdG可作為膠質(zhì)瘤病理級別的輔助性診斷指標。

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤其預(yù)后與其病理級別關(guān)系密切，高級別膠質(zhì)瘤尤其是間變性星型細胞瘤(WHO Ⅲ級)和膠質(zhì)母細胞瘤(WHO Ⅳ級)平均生存期分別為30～36個月和10～15個月[1]。雖然低級別膠質(zhì)瘤的預(yù)后較高級別膠質(zhì)瘤好，但膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)時往往伴有病理級別的進展，這種病理級別進展的機制目前尚不明確，可能與基因組的改變有關(guān)[2-3]。由于腦組織的特殊性,使其容易遭受氧化性損傷,尤其是膠質(zhì)瘤術(shù)后腦組織的出血、小血管痙攣、腦水腫、再灌注損傷及炎癥反應(yīng)等,更是加重了細胞的氧化性損傷。在DNA 氧化損傷中,8-羥基脫氧鳥苷﹙8-hydroxy deoxyguanosine,8-OHdG﹚是最具代表性的損傷產(chǎn)物,已成為目前評估氧化應(yīng)激和DNA氧化損傷的常用敏感生物標志物[4]。8-OHdG在膠質(zhì)瘤組織中的表達國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用免疫組化SP法檢測不同級別膠質(zhì)瘤組織中8-OHdG的表達情況，并結(jié)合臨床資料分析其與膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系及意義。

材料與方法

1 材 料 ①標本：選取我院2011年1月至2011年12月行手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤標本共45例，經(jīng)病理證實均為膠質(zhì)瘤。其中星型細胞瘤38例，少突膠質(zhì)細胞瘤4例，膠質(zhì)母細胞瘤3例。男26例，女19例，年齡25～72歲，平均年齡49.40±12.74歲。按WHO膠質(zhì)瘤分級標準(2007年)分級，Ⅰ級7例、Ⅱ級22例、Ⅲ級12例、Ⅳ級4例。②試劑：8-OHdG單克隆抗體N45.1購自亞諾法生技股份有限公司(Abnova, Taiwan)，DAB顯色試劑盒、SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

2 方 法 標本常規(guī)石蠟包埋制成4μm切片，采用免疫組化SP法進行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波抗原修復(fù)，依次滴加過氧化物酶阻斷液(37℃封閉10min)、10%非免疫性動物血清(37℃孵育40min)、8-OHdG一抗工作液(1∶200稀釋，4℃孵育過夜)、生物素標記的二抗(37℃孵育20min)、S-A/HRP(37℃孵育20min)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。用已知表達8-OHdG蛋白陽性的皮膚組織作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

3 結(jié)果判定 細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，每張切片400倍光鏡下連續(xù)觀察5個視野，計數(shù)細胞，根據(jù)陽性細胞的比率和染色深度分別評估，最后綜合評定。陽性細胞的比率評分：0分為陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)<10%，1分為陽性細胞占總細胞數(shù)11%～25%，2分為陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)26%～50%，3分為陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)>50%。染色深度評分：0分為無染色，1分為淡黃色，3分為棕黃色，2分為染色強度介于1分和3分之間?？偡?陽性細胞比率評分+染色深度評分：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中強陽性()，5～6分為強陽性()。

結(jié) 果

1 不同級別膠質(zhì)瘤臨床特征比較 見表1。高級別組和低級別組膠質(zhì)瘤患者的性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而且，高級別組膠質(zhì)瘤患者年齡(51.00±12.65歲)與低級別組患者年齡(48.00±12.68歲)之間亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同級別膠質(zhì)瘤患者年齡、性別的比較

注：年齡的比較采用t檢驗，性別比較采用卡方檢驗

2 8-OHdG在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達 見表2。8-OHdG定位于細胞核，陽性著色為黃色或棕黃色核著色(見附圖)。低級別(Ⅰ～Ⅱ級)組8-OHdG表達強度中度或強陽性(～)者占13.79%(4/29)，而高級別(Ⅲ～Ⅳ級)組占50%(8/16)，兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 8-OHdG表達與膠質(zhì)瘤臨床特征之間的關(guān)系 見表3。在男性膠質(zhì)瘤患者中，8-OHdG表達中度或強陽性(～)者占26.92%(7/26)，在女性膠質(zhì)瘤患者中占26.31%(5/19)，兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.020，P=0.964)。50歲以下患者8-OHdG表達強度中度或強陽性(～)者占33.33%(7/21)，50歲以上患者占20.83%(5/24)，兩者之間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.895，P=0.344)。

表2 8-OHdG在不同級別膠質(zhì)瘤中表達的比較

注：χ2=6.912，P=0.014

A：Ⅰ級； B：Ⅱ級； C：Ⅲ級； D：Ⅳ級

表3 8-OHdG在不同性別、年齡組中表達的比較

注：年齡、性別比較均采用卡方檢驗

討 論

活性氧(ROS)是氧化應(yīng)激主要的表現(xiàn)形式，過多的自由基可以直接引起生物脂質(zhì)膜的過氧化、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、DNA損傷，從而導(dǎo)致細胞受損，其中活性最強的ROS表現(xiàn)形式是羥自由基(HO.)。DNA中所有的嘌呤和嘧啶均可能受到ROS的攻擊，但以鳥嘌呤(G)最易被修飾。羥自由基攻擊DNA鏈上的鳥嘌呤堿基，使C-8位發(fā)生羥化而生成8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，后者是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物之一[5]。

8-OHdG代表DNA氧化性損傷程度，意味著細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多、抗氧化系統(tǒng)異常或DNA修復(fù)系統(tǒng)缺陷。內(nèi)源性的ROS產(chǎn)生主要來源于線粒體，與呼吸鏈的電子傳遞有關(guān)，當該過程受到抑制時細胞內(nèi)ROS會明顯升高[6]。ROS的促腫瘤作用體現(xiàn)在直接或間接兩方面。前者指ROS對基因組DNA的直接損傷，比如所形成的8-OHdG可以與C以外的其他堿基配對形成點突變，其中GC-TA突變的發(fā)生已被大量研究證實[7]。另外ROS可以作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子，激活包括NF-κB、AP-1等在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致與細胞生長相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄異常，間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。機體的抗氧化系統(tǒng)分為酶和非酶系統(tǒng)兩大類，前者包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶，后者包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽、硫氧還原蛋白等，在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)中具有重要意義。在一般情況下機體修復(fù)機制正常時，8-OHdG等DNA氧化性損傷產(chǎn)物可以在人8-羥基鳥嘌呤糖苷酶(hOGG1)等的作用下從DNA鏈上切除并重新?lián)饺胝５镍B嘌呤堿基，避免由于錯配導(dǎo)致的基因突變[9]。

目前，8-OHdG在膠質(zhì)瘤組織中的表達國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用免疫組化法檢測膠質(zhì)瘤組織中的8-OHdG表達水平，結(jié)果表明：8-OHdG在高級別(Ⅲ～Ⅳ級)膠質(zhì)瘤中的表達強于低級別(Ⅰ～Ⅱ級)膠質(zhì)瘤，提示8-OHdG所代表的DNA氧化性損傷在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、病理級別進展中具有重要意義。膠質(zhì)瘤的病理級別與其預(yù)后密切相關(guān)，研究顯示低級別膠質(zhì)瘤較高級別膠質(zhì)瘤無進展生存期長28個月[10]。但是初發(fā)膠質(zhì)瘤并非停滯不前，復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤往往伴隨有病理級別的進展。這種病理級別進展的機制目前尚不明確，通過基因芯片等多方面的研究表明膠質(zhì)瘤病理級別的進展可能與腫瘤基因組改變有關(guān)。黃強等通過基因芯片發(fā)現(xiàn)197條在惡性進展膠質(zhì)瘤中高表達的基因，并通過生物信息學(xué)方法分析出其中17條與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3]。而8-OHdG形成所導(dǎo)致的堿基錯配是基因突變的一個重要原因，因此膠質(zhì)瘤的進展可能與細胞內(nèi)持續(xù)性的DNA氧化性損傷相關(guān)。

由于大腦的高代謝活性、相對性低抗氧化系統(tǒng)、低DNA修復(fù)能力，導(dǎo)致膠質(zhì)細胞容易受到氧化性損傷。尤其是對于膠質(zhì)瘤術(shù)后患者，手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的出血、小血管痙攣、腦水腫、再灌注損傷及炎癥反應(yīng)，均可以加重氧化性損傷[11]。另外腦組織較其他組織含有更多的金屬離子(比如鐵離子)，這些金屬離子在催化過氧化氫形成高活性的羥自由基中是必需的，羥自由基是最具損傷性的活性分子，這也是腦組織容易遭受氧化性損傷的重要原因[12]。本研究從氧化損傷方面揭示了膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，同時也提示對于膠質(zhì)瘤術(shù)后患者給予自由基清除劑、抗氧化劑等藥物可能減輕膠質(zhì)瘤術(shù)后氧化性損傷，防止DNA損傷加重導(dǎo)致疾病惡化。另一方面，本研究結(jié)果提示8-OHdG可作為膠質(zhì)瘤進展的輔助性生物標記物。

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(收稿：2014-09-22)

Expression and significance of 8-OHdG in different graded glioma

Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Lian Minxue Feng Hongfei Jiang Haitao et al

Objective：To evaluate the expression and significance of 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHdG) in different degraded glioma.Methods：SP immunohistochemistry was employed to detect the expression of 8-OHdG in forty-five different degraded glioma,and the relationship between the expression of 8-OHdG and clinical features of glioma was analyzed.Results：The expression of 8-OHdG was stronger in high grade glioma (Ⅲ～Ⅳ grade) group than that in low grade glioma (Ⅰ～Ⅱ grade) group, and there was no statistical significance of 8-OHdG expression in different age and gender glioma patients. Conclusion：DNA oxidative damages is much serious in high grade glioma tissues. 8-OHdG can be a marker for the pathological diagnosis of glioma.

Glioma Immunohistochemistry @Oxidative damage @8-hydroxy deoxyguanosine

神經(jīng)膠質(zhì)瘤 免疫組織化學(xué) @氧化損傷 @8-羥基脫氧鳥苷

R739.41

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.009

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2012K13-02-14)