西安交通大學第二附屬醫(yī)院胸外科(西安710004)

席俊峰△ 周 斌

MACC1基因干涉對食管癌細胞Eca109體外和體內(nèi)增殖的影響

西安交通大學第二附屬醫(yī)院胸外科(西安710004)

席俊峰△周 斌

目的：探討MACC1對食管癌細胞Eca109增殖的影響。方法：利用慢病毒載體介導的小發(fā)卡RNA(shRNA)干涉食管癌細胞Eca109中MACC1的表達。利用MTT法和平板克隆試驗檢測MACC1對食管癌細胞增殖的影響，利用流式細胞儀檢測細胞周期的變化，最后利用裸鼠成瘤試驗檢測MACC1對食管癌細胞體內(nèi)增值的影響。結(jié)果：成功建立MACC1干涉的食管癌細胞,MTT和平板克隆結(jié)果顯示MACC1基因干涉后抑制食管癌細胞的增殖,并使食管癌細胞發(fā)生G1期阻滯。體內(nèi)試驗進一步證實MACC1干涉后抑制食管癌細胞在體內(nèi)的增值。結(jié)論：干涉MACC1基因可抑制食管癌細胞的增殖。

MACC1是利用全基因組表達分析技術在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的一個新基因[1]。研究結(jié)果顯示，MACC1在很多腫瘤組織中高表達，并且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關，但其在食管癌細胞中的作用尚不清楚。本研究擬利用慢病毒建立MACC1干涉的Eca109細胞系,初步探討MACC1基因?qū)κ彻馨┘毎鲋车挠绊憽?/p>

材料與方法

1 材 料 人食管癌細胞系Eca109購自中國科學院細胞庫。293T細胞由第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院胸外科鐘代星博士提供。慢病毒干涉構(gòu)建質(zhì)粒pLKO.1-TRC control、pLKO.1- scramble shRNA、psPAX2、pMD2.G購自Addgene公司。兔抗人MACC1多克隆抗體購自abcam公司,小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自博士德公司。RT-PCR試劑盒及引物購自Takara公司。脂質(zhì)體2000和嘌呤霉素購自Invitrogen公司。

2 構(gòu)建MACC1干涉的Eca109穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系 將兩個MACC1 shRNA(shMACC1-1：AAGATTGGACTTGTACACTGC,shMACC1-2: AAGCTTGGAAAAGGCTGGAGG)分別導入到pLKO.1載體中[2]。按照脂質(zhì)體2000說明將pLKO.1-shRNA、psPAX2、pMD2.G三種質(zhì)粒按照比例轉(zhuǎn)入到293T細胞內(nèi)。12h后移除轉(zhuǎn)染試劑，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h并收集病毒液，0.45 μm濾器過濾。將病毒液滴入食管癌細胞Eca109中(大約70%密度),培養(yǎng)48h加入嘌呤霉素(1mg/ml)。經(jīng)3周的篩選培養(yǎng),挑出單個克隆并擴增,建立對照細胞系Eca109-SC和MACC1干涉的兩組細胞系Eca109-S1和Eca109-S2。

3 RT-PCR檢測各組細胞內(nèi)MACC1 mRNA的表達 按Trizol試劑盒說明書分別提取各組細胞總RNA。RT-PCR反應按照試劑盒說明進行操作。MACC1引物序列：5’-CCTTCGTGGTAATAATGCTTCC-3’ ，5’-AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT-3’。GAPDH引物序列： 5’-GCCTCAAGATCATCAGCAAT -3’，5’- AGGTCCACCACTGACACGTT -3’。反應條件為：94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30 s,反應30個循環(huán)；最后72℃ 10 min，4℃保存。然后行agrose凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果,并照相。

4 Western-blot檢測各組細胞內(nèi)MACC1 蛋白的表達 分別提取細胞的總蛋白。按照蛋白定量試劑盒說明書 BCA 法進行總蛋白定量,取 50μg蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜上,標記預染marker的位置。50mg/L 脫脂牛奶封閉，一抗為1∶500 稀釋的抗MACC1 mAb,4℃,過夜,二抗室溫孵育1h,暗室內(nèi)加增強化學發(fā)光試劑 ( ECL ),X光片顯影。

5 MTT檢測各組細胞的增值情況 取對數(shù)生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞分別加入到96孔板中,每孔約5×103細胞,培養(yǎng)基體積為200ml。每點設4個復孔,共鋪7塊96孔板。放置孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，隔兩天更換一次培養(yǎng)基。各組細胞接種后每24 h分別收集一次細胞樣品,收集7 d；在酶聯(lián)免疫儀上選擇490nm波長測定吸光值。最后統(tǒng)計數(shù)據(jù),繪制生長曲線。

6 平板克隆試驗檢測各組細胞克隆形成情況 取對數(shù)生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞分別接種于直徑為 6cm 的培養(yǎng)皿,每個皿接種的細胞數(shù)控制在200個左右,10ml 含每組設3個復孔。十字形晃動使細胞均勻分布。培養(yǎng)14d。以后每隔兩天更換培養(yǎng)基一次。培養(yǎng) 14d后,當培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時中止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基。PBS洗滌3次,加入5 ml甲醇固定15 min。棄去固定液,加入 2ml 姬姆薩應用液染色20min。用蒸餾水緩慢洗去姬姆薩染液,將培養(yǎng)皿放置于空氣中干燥后倒置；用肉眼直接計數(shù)紫色的細胞克隆數(shù)并拍照。進行統(tǒng)計分析，繪制直方圖。

7 流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化 取對數(shù)生長的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞，無血清DMEM 培養(yǎng)基24h，然后將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合度80%～90%時收集細胞，做周期分析。細胞固定：胰酶將細胞消化下來后，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應，800rpm，5min。然后PBS洗兩次，70%乙醇1ml重懸細胞，充分吹勻，避免細胞形成團塊。然后放置4℃冰箱過夜，離心棄去上清后用PBS洗滌細胞2次；用100 μl PBS重懸各組細胞，300 μl碘化丙啶染色液15 min。用FCM檢測。細胞周期分析采用美國Becton.Diekinson公司的CellQuit Plot分析軟件。

8 裸鼠成瘤試驗 取對數(shù)生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞,常規(guī)消化細胞、離心并計數(shù)，取5×106個細胞,再次離心收集細胞沉淀。用0.2ml生理鹽水或者PBS重懸細胞,分別移至0.5ml的EP管內(nèi),封口膜封口。將裸鼠側(cè)腹部皮膚消毒。用1ml注射器吸取細胞懸液,將其注射到裸鼠皮下。每天觀察裸鼠一般狀況及腫瘤生長情況,記錄腫瘤生成的潛伏期,測量腫瘤的體積，接種細胞后第28 天,用頸椎脫臼法處死裸鼠,解剖取出瘤體。用微量天平稱重，按以下公式計算腫瘤體積，腫瘤體積=長徑×短徑2/2,根據(jù)腫瘤體繪制腫瘤生長曲線。

9 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 17.0版本統(tǒng)計軟件對實驗中所得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,使用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建MACC1干涉的Eca109穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系 使用RT-PCR 方法檢測MACC1 mRNA在Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2細胞中MACC1 mRNA表達量顯著減少(P<0.01)(圖1A)。使用Western-blot方法檢測MACC1蛋白在Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2細胞中MACC1 蛋白表達量顯著減少(P<0.01)(圖1B)。

圖1 各組細胞中MACC1 mRNA 和蛋白的相對變化

2 MACC1基因干涉抑制Eca109細胞的增殖 以Eca109-SC細胞為對照，利用MTT法檢測Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞的增值情況并繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示，與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2兩組細胞生長明顯受到抑制，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而Eca109-S1和Eca109-S2兩組細胞之間未見明顯差異(圖2A)。平板克隆結(jié)果顯示，經(jīng)過14天的培養(yǎng)，Eca109- SC組克隆數(shù)為：126±12，Eca109-S1和Eca109-S2兩組克隆數(shù)分別為：83±8和96±10，明顯少于對照組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2B)。

圖2 MACC1干涉對食管癌細胞Eca109增殖的影響

3 流式細胞術(FCM)測定細胞周期變化 采用流式細胞術檢測細胞周期，結(jié)果顯示，與對照組Eca109-SC相比，Eca109-S1和Eca109-S2兩組細胞G0/G1周期細胞明顯增加(P<0.01)，而G2/M期和S期細胞周期分部無明顯差異。表明干涉MACC1后，細胞發(fā)生G1期阻滯，從而抑制了細胞的增值(圖3)。

圖3 MACC1干涉對食管癌細胞Eca109細胞周期的改變

4 MACC1基因干涉抑制Eca109細胞體內(nèi)成瘤能力 種植Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三組細胞的裸鼠,在接種后7d左右均形成可見的腫瘤結(jié)節(jié),每3天使用游標卡尺測量腫瘤體積變化，Eca109-SC組腫瘤生長迅速，而Eca109-S1和Eca109-S2兩組腫瘤相對較慢。接種四周后統(tǒng)一頸椎脫臼法處死裸鼠，解剖出腫瘤，測量體積并稱重，結(jié)果顯示，Eca109-S1和Eca109-S2兩組腫瘤體積和重量明顯小于對照組腫瘤體積和重量，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 MACC1干涉對食管癌細胞Eca109體內(nèi)成瘤的影響

討 論

2009年Ulrike等[1]通過全基因組表達分析技術分析結(jié)腸癌的癌灶轉(zhuǎn)移灶及正常結(jié)腸組織之間基因表達差異時發(fā)現(xiàn)一個新的基因-MACC1，發(fā)現(xiàn)MACC1是診斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預測結(jié)腸癌患者無病生存期的一個獨立指標，并且證明MACC1通過HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導通路促進腫瘤細胞的增值、浸潤和轉(zhuǎn)移。MACC1基因定位于人類7號染色體(7p21.1),由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成,其cDNA序列中含2559個核苷酸序列。MACC1基因編碼由852個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其主要結(jié)構(gòu)包括：SH3結(jié)構(gòu)域、ZU5結(jié)構(gòu)域、DD1區(qū)和DD2區(qū)結(jié)構(gòu)片段[3]。進一步的實驗研究表明,MACC1在多種實體腫瘤中表達增高,比如：胃癌、肝癌[4]、肺癌[5]和卵巢癌[6]等,并且能夠很好地預測患者的預后。在胰腺癌患者的血清中,與健康人相比,MACC1的蛋白水平明顯升高,并MACC1的蛋白水平與腫瘤的TNM分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關。在胰腺癌細胞中干涉MACC1的表達后,可明顯抑制細胞的增值、轉(zhuǎn)移以及EMT,而且MACC1可作為吉西他濱治療胰腺癌效果的預測分子,提示MACC1可能有助于胰腺癌的個體化治療[7]。王建軍等[8]報道MACC1蛋白在食管癌組織

中的表達水平高于癌旁組織，MACC1蛋白的表達水平與食管癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度顯著相關，提示MACC1的異常表達與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

本實驗利用慢病毒載體成功構(gòu)建MACC1基因干涉的Eca109穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，為深入研究MACC1基因在食管癌的作用提供了試驗基礎。MTT試驗和平板克隆試驗結(jié)果顯示食管癌細胞Eca109中MACC1基因干涉后，其生長速度以及克隆數(shù)明顯下降，提示干涉MACC1基因可抑制食管癌細胞Eca109的增殖能力。細胞周期分析結(jié)果顯示MACC1通過使食管癌細胞發(fā)生G1期阻滯，從而抑制細胞的增殖。體內(nèi)試驗進一步證實：干涉MACC1基因可抑制食管癌細胞Eca109在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。綜合上述研究，提示MACC1有可能成為食管癌基因治療的一個新靶點。其分子機制還需要我們進一步研究。

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(收稿：2014-03-10)

△陜西省榆林市第一醫(yī)院

食管腫瘤 基因表達調(diào)控,腫瘤 細胞增殖 @MACC1基因

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.005