西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心(西安710004)

饒國洲 石建峰 王欣欣 魏 虹 李 昂 孫惠玲 張引成

Survivin和Bcl-2基因靶向siRNA對舌癌Tca-8113細(xì)胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的影響*

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心(西安710004)

饒國洲 石建峰 王欣欣 魏 虹 李 昂 孫惠玲 張引成

目的：探討Survivin聯(lián)合Bcl-2 siRNA對舌癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。方法：實驗分空白組、脂質(zhì)體組、陰性干擾組、Survivin干擾組、bcl-2干擾組、Survivin/ bcl-2干擾組，以舌癌細(xì)胞系Tca-8113為研究對象，應(yīng)用小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)分別和同時沉默下調(diào)Survivin和Bcl-2兩種基因的表達，采用MTT檢測細(xì)胞增殖抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，透射電鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，比較各組對腫瘤細(xì)胞生長的抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果：轉(zhuǎn)染24h后可見Survivin/ bcl-2干擾組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，體積縮小變圓，染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)側(cè)，核碎裂，電鏡下呈典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，并有凋亡小體出現(xiàn)，MTT顯示細(xì)胞生長明顯抑制，MCF檢測凋亡率分別為空白組0.85%、脂質(zhì)體組2.46%、陰性干擾組3.06%、Survivin干擾組15.48%、bcl-2干擾組11.02%、Survivin/ bcl-2干擾組29.18%，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義(P<0.01)，轉(zhuǎn)染陰性siRNA及脂質(zhì)體組無抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： 靶向特異性Survivin聯(lián)合Bcl-2 siRNA雙基因沉默下調(diào)較單基因沉默下調(diào)作用顯著增強，并且能有效抑制舌癌細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

研究表明[1-2]，siRNA可介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞特異性基因沉默，具有高效性和特異性,已成為基因功能研究和腫瘤基因治療的新技術(shù)。本研究通過RNA干擾使舌癌細(xì)胞Survivin、bcl-2基因共沉默，同時與單一RNA干擾Survivin基因和bcl-2基因進行比較研究,觀察轉(zhuǎn)染后舌癌Tca-8113細(xì)胞的Survivin和bcl-2基因的表達,以及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，探討RNAi后的協(xié)同效果及作用機制和對舌癌細(xì)胞增殖凋亡的影響,以期為舌癌的基因治療和其他相關(guān)的腫瘤生物治療探索更加有效的治療方案。

材料與方法

1 材 料 細(xì)胞株及RNA干擾載體：人舌癌Tca-8113細(xì)胞株(由本實驗室保存)，應(yīng)用含10g/dl小牛血清和100μg/ml雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)；Survivin shRNA，Bcl-2 shRNA(由本室構(gòu)建)；酶標(biāo)分析儀(Amersham)；流式細(xì)胞儀(BD)；透射電鏡(日立)；恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)；臺式離心機(Sigma)；熒光倒置顯微鏡(Nikon)；RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclon)；小牛血清(Gibco)；MTT(Amresco)；脂質(zhì)體(Invitrogen)。

2 方 法 ①siRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞：細(xì)胞數(shù)調(diào)成1×105接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長至80%時轉(zhuǎn)染。用無血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒DNA至100μl混勻，同時稀釋6μl脂質(zhì)體至100μl，兩液混勻，室溫放置20 min。轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞數(shù)次，將800μl 無血清培養(yǎng)基緩慢加入以上混合液混勻，加入培養(yǎng)細(xì)胞中，37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)。5h后補加20%小牛血清的完全培養(yǎng)基。②MTT檢測：轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為6組，每組設(shè)6個復(fù)孔，以1×107細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72h在酶標(biāo)儀上570nm波長處檢測各孔A值。抑制率(%)=(1-實驗組A值/空白對照組A值)×100% 。③流式細(xì)胞儀檢測：將各組細(xì)胞用0.25%胰酶消化離心收集，細(xì)胞數(shù)1×106個，用PBS洗2次，加入100μl Binding Buffer和10μl FITC熒光標(biāo)記的AnnexinV(20μg/ml)，室溫避光30min，加5μl PI(50μg/ml)，避光反應(yīng)5min后，加入400μl Binding Buffer。同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作陰性對照，立即上流式細(xì)胞儀檢測。④透射電鏡觀察：收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞數(shù)大于1×106個，用PBS洗2次后3%戊二醛固定，PBS洗2次，再用1%鋨酸固定，丙酮酸梯度脫水。細(xì)胞經(jīng)包埋后超薄切片染色，透射電鏡觀察。

結(jié) 果

1 RNAi載體成功轉(zhuǎn)染Tca-8113細(xì)胞 將帶紅色熒光表達蛋白的Bcl-2 RNAi載體和帶綠色熒光表達蛋白的Survivin RNAi載體分別轉(zhuǎn)染到Tca-8113細(xì)胞中，24h后在熒光倒置顯微鏡下觀察到在同一個細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色和綠色熒光，表明靶向特異性Survivin/ Bcl-2雙基因轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

(A:Bcl-2shRNA;B:Survivin shRNA;C:Survivin/Bcl-2shRNA)

2 倒置顯微鏡下細(xì)胞學(xué)形態(tài) 轉(zhuǎn)染前Tca-8113細(xì)胞呈鋪路石樣生長，細(xì)胞完整、輪廓清晰，增殖旺盛，轉(zhuǎn)染后Tca-8113細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，體積縮小變圓，染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)側(cè)，核碎裂，細(xì)胞生長明顯抑制。見圖2。

(A：轉(zhuǎn)染前Tca-8113細(xì)胞;B：轉(zhuǎn)染后Tca-8113細(xì)胞)

3 MTT檢測結(jié)果 經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后，分別于培養(yǎng)12、24、48、72h收集細(xì)胞，采用MTT檢測細(xì)胞增值抑制作用，結(jié)果顯示沉默bcl-2后抑制率分別為9.1%、20.6%、29.8%、35.4%，沉默survivin后抑制率分別為13.6%、29.4%、36.2%、43.08%，沉默bcl-2/survivin后抑制率分別為18.2%、35.3%、44.7%、56.9%。各干擾組細(xì)胞增值能力與對照組相比受到明細(xì)抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義(P<0.01)，各干擾組間細(xì)胞增值能力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染陰性siRNA及脂質(zhì)體組無抑制作用，兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)和 RNA干擾作用時間的延長，細(xì)胞的生長抑制呈時間依賴性。見圖3。

4 流式細(xì)胞儀分析顯示 Tca-8113細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染24h后，空白組、脂質(zhì)體組、陰性對照組、Survivin 干擾組、Bcl-2干擾組、Survivin/ Bcl-2干擾組，凋亡率分別為0.85%、2.46%、3.06%、15.48%、11.02%及29.18%，RNA干擾組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義(P<0.01)，雙基因沉默組較單基因沉默組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染陰性shRNA、脂質(zhì)體及空白對照組無誘導(dǎo)凋亡作用，各組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

5 透射電鏡檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體和陰性對照及空白對照的Tca-8113細(xì)胞包膜完整，胞核圓形或不規(guī)則，核仁大而明顯，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布不均，未見到凋亡細(xì)胞及凋亡小體。轉(zhuǎn)染靶向Survivin及 Bcl-2 siRNA的Tca-8113細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)團塊狀凝聚、邊集，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝集的凋亡細(xì)胞，其核內(nèi)形成高電子密度的團塊，且核膜缺損，核碎裂后分散在細(xì)胞突起內(nèi)，部分突起與細(xì)胞分離，形成凋亡小體。見圖5。

圖3 不同干擾組對Tca-8113細(xì)胞增值抑制作用的影響

(A:空白對照組；B:脂質(zhì)體對照組；C:陰性對照組；D:Survivin干擾組；E：Bcl-2干擾組；F：Survivin/Bcl-2干擾組)

(A：轉(zhuǎn)染前Tca-8113細(xì)胞;B：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞核內(nèi)形成凋亡小體)

討 論

Survivin基因或 BIRC5又稱生物存活素，屬于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制基因[3]，其在正常組織中幾乎不表達，但在所有惡性腫瘤中均有明顯表達。bcl-2是研究最深入的凋亡調(diào)控基因之一[4]，能延長細(xì)胞壽命，但對細(xì)胞周期和分化不產(chǎn)生影響，bcl-2高表達能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素如射線、化學(xué)藥物等所引發(fā)的細(xì)胞凋亡。bcl-2基因在乳腺癌、卵巢癌、以及胃腺癌等多種人類腫瘤細(xì)胞中都顯著升高。近些年這來兩種基因倍受腫瘤研究領(lǐng)域廣泛關(guān)注，目前對Survivin和Bcl-2在舌鱗癌中的表達已有較深入的研究及報道。

徐亞娟等[5]， Survivin蛋白在舌鱗癌組織中表達陽性率為56.3%，癌旁組織中陽性表達為25.0%，正常舌粘膜中表達陰性。王智明等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)， Survivin與Bcl-2在舌鱗癌組織中蛋白表達陽性率分別為68.9%和60.0%，正常舌粘膜中陰性表達。并且隨著細(xì)胞分化程度越低陽性表達率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的兩者之間差異顯著。籍麗莉[8]報道，Survivin在口腔鱗癌組織中表達陽性率高達88.89%，正常組織中無表達。

以上研究表明了Survivin和Bcl-2在口腔鱗癌組織中表達兩者成正相關(guān)性， Survivin和Bcl-2的異常表達與舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，表明Survivin單獨或協(xié)同bcl-2發(fā)揮了抗凋亡作用，也證明了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與多個基因相互作用相關(guān)。提示靶向 Survivin和Bcl-2 RNA干擾治療口腔鱗癌的可行性。

目前，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在腫瘤細(xì)胞中沉默單個基因的表達研究已有較多文獻報道，同時沉默兩種基因的表達報道較少，尤其在舌癌細(xì)胞系Tca-8113細(xì)胞中干擾沉默下調(diào)兩個凋亡抑制基因的表達還未見報道。本研究在前期的工作中已成功構(gòu)建了Survivin和Bcl-2慢病毒RNA干擾載體，并篩選出最佳干擾序列。在本研究中，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染siRNA到Tca-8113細(xì)胞中，沉默下調(diào)Survivin、bcl-2基因的表達，觀察到舌癌細(xì)胞生長增殖明顯減慢和抑制，細(xì)胞縮小變圓、數(shù)量減少及出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，在電鏡下細(xì)胞核內(nèi)可見明顯的凋亡小體。這種抑制和凋亡程度隨干擾時間的延長而增加，且具有時間依賴性。在實驗中發(fā)現(xiàn)沉默Survivin基因誘導(dǎo)凋亡作用高于沉默bcl-2基因，顯示出Survivin基因抑制凋亡作用強于bcl-2基因的作用，雙基因沉默下調(diào)較單基因沉默下調(diào)細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)，RNA干擾組的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義(P<0.01)。由于Survivin和Bcl-2分別作用于凋亡通路的不同位點對凋亡抑制產(chǎn)生協(xié)同作用。推測當(dāng)靶向特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，沉默下調(diào)了Survivin和Bcl-2基因的表達，解除了Survivin直接抑制caspase蛋白酶的作用，和抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase-3和caspase-7的活性或干擾caspase-9的活性，以及各種刺激誘導(dǎo)的下游細(xì)胞凋亡的共同通路[9]。同時解除了bcl-2通過干擾細(xì)胞色素C自線粒體釋放，而阻斷caspase蛋白酶的激活[10]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。蔡明等[11]報道，沉默單基因的凋亡作用較同時沉默兩種基因的效果好，認(rèn)為沉默兩種作用于共同凋亡通路的基因，相互存在競爭和抑制作用導(dǎo)致其聯(lián)合沉默作用的降低。由于本研究沉默的Survivin和Bcl-2基因抑制凋亡途經(jīng)及作用凋亡通路的位點有所不同，本研究觀察到聯(lián)合沉默雙基因具有協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用。在本研究中除沉默下調(diào)Survivin和Bcl-2基因以外，可能還有多種基因參與誘導(dǎo)凋亡作用有關(guān)，如caspase、P53、P21、Bax等，有待于更深入的研究。

舌癌是口腔頜面部發(fā)病率最高的鱗狀細(xì)胞癌，其惡性程度非常高，由于舌的解剖和功能特點，早期即發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前舌癌是以手術(shù)為主的綜合治療，如能采取其他有效的治療方法控制早期癌變，臨近亞病灶、微小病灶及轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)展，則可以減少手術(shù)切除范圍，提高患者生存質(zhì)量，而晚期舌癌手術(shù)治療困難，臨床中多采用放、化療，由于腫瘤細(xì)胞對放、化療的不敏感性及耐藥性，往往治療效果不佳。本實驗結(jié)果表明，聯(lián)合沉默Survivin和Bcl-2兩種抗凋亡基因的表達，其對細(xì)胞的生長增值抑制和誘導(dǎo)凋亡作用強于沉默單基因的作用，這種協(xié)同作用和效果有助于腫瘤細(xì)胞對放、化療敏感性的增加及降低耐藥性，有助于更深入了解Survivin和Bcl-2 siRNA的作用機制及其在腫瘤基因治療中的作用，為臨床舌癌的治療提供實驗依據(jù)。

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(收稿：2014-08-19)

致 作 者

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陜西醫(yī)學(xué)、陜西中醫(yī)雜志社

*陜西省社發(fā)攻關(guān)項目(2009K12-01)

舌腫瘤 RNA干擾 基因, bcl-2 細(xì)胞凋亡 @Survivin基因 @Tca-8113細(xì)胞

R379.36

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.004