周海哲李香李軍

陜西中醫(yī)學(xué)院( 咸陽 712046)

腦清通混懸顆粒對高血壓模型大鼠ET、AngⅡ、CGRP的影響*

周海哲李 香△李 軍

陜西中醫(yī)學(xué)院( 咸陽 712046)

目的： 探討腦清通混懸顆粒對血壓及內(nèi)皮素(ET)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的影響。方法：將70只同批、同飼養(yǎng)條件成年SD大鼠隨機分為空白組10只，造模組60只。造模組給予慢性復(fù)合應(yīng)激進(jìn)行高血壓造模14d，自復(fù)合刺激造模第2周起同時配合高脂乳劑灌胃法進(jìn)行肝熱痰瘀證型造模，連續(xù)高脂乳劑灌胃10d。將造模成功的大鼠選取50只，隨機分為高血壓模型組，腦清通混懸顆粒大、中、小劑量組及卡托普利藥物對照組。分別給予相應(yīng)量的生理鹽水、腦清通混懸顆粒大、中、小劑量和卡托普利溶液灌胃3w，觀察其對大鼠血壓、ET、AngⅡ、CGRP的變化，以及胸主動脈血管壁形態(tài)的影響。結(jié)果：腦清通混懸顆粒各劑量組均可有效的抑制大鼠血壓升高趨勢，但降壓作用以第3周為著，治療前、后及其與模型組比較有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)；腦清通混懸顆粒各劑量組與模型組比較ET、AngⅡ含量降低，CGRP含量升高，具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)；光鏡下結(jié)果：模型組血管壁內(nèi)膜水腫，膠原纖維增生，管壁脂質(zhì)細(xì)胞增多甚或附有斑塊，平滑肌組織增生；腦清通混懸顆粒大、中劑量組較模型組內(nèi)膜相對光滑，局部有少量脂質(zhì)細(xì)胞粘附，膠原纖維、平滑肌組織增生不明顯，明顯好于模型組。 結(jié)論：腦清通混懸顆粒治療肝熱痰瘀型高血壓大鼠作用的機理可能是通過對血清ET、CGRP、AngⅡ的調(diào)節(jié)，起到保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用，而血管內(nèi)皮功能得到改善則血壓可相應(yīng)的下降。

高血壓病是心、腦血管疾病的重要病因與危險因素，影響心、腦、腎等重要臟器的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致這些器官功能的衰竭，至今仍是心腦血管疾病的主要死亡原因之一。高血壓病對人類的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，但目前國內(nèi)外尚無根治的方法。隨著近年來對血管壁內(nèi)皮細(xì)胞生成、激活、釋放的血管活性肽認(rèn)識的不斷深入，在細(xì)胞分子學(xué)領(lǐng)域，對高血壓病的認(rèn)識有了新的進(jìn)展。腦清通混懸顆粒是中藥復(fù)方制劑，具有清肝活血、滌痰通絡(luò)之效。本實驗通過對肝熱痰瘀型高血壓模型大鼠應(yīng)用腦清通混懸顆粒前、后的血壓及ET、AngⅡ、CGRP及血管壁形態(tài)變化，來初步分析其治療高血壓病的作用機理。

1 材 料 1.1 藥 物 復(fù)方腦清通混懸顆粒：將草決明、丹參、姜半夏、野菊花等按一定比例配伍組成，分別用醇提水沉法提取、濃縮、干燥、制粒，制成顆粒劑，由陜西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號120710。

1.2 實驗動物 同批、同飼養(yǎng)條件成年SD大鼠70只，雌雄各半，體重180～220g，動物合格證號：醫(yī)動字第07―001號，一級；由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.3 高脂飼料的制備[1]按照膽固醇10g，豬油20g，牛磺膽酸鈉2g，4-甲基硫氧嘧啶1g，吐溫-80 20 mL，丙二醇30mL，蒸餾水加至100 mL的比例配制。首先將豬油加熱熔化，然后加入膽固醇進(jìn)行攪拌，使其熔化后，再加入牛磺膽酸鈉及甲基硫氧嘧啶，充分?jǐn)噭蚝?，再放入丙二醇、吐?80及蒸餾水，將其不斷攪拌，等制備的高脂乳劑全部熔化后，再將其冷卻至室溫，置入冰箱內(nèi)4℃保存。使用時置于37℃的水浴中熔化。

1.4 實驗儀器 RBP-1B型無創(chuàng)大鼠血壓測定儀(由北京中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所生產(chǎn))；便攜式音箱，大鼠固定臺，一次性注射器，小血管鉗，灌胃用鈍頭針頭，醫(yī)用一次性無菌手套，肝素抗凝管，電子天平等。

2 方 法 2.1 造模及分組 2.1.1 造模:參照王秀卿等[2]慢性復(fù)合應(yīng)激性高血壓大鼠模型的建立方法，實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，首先從70只實驗大鼠中隨機抽出10只來作為空白組(A組)，其余60只隨機分為B、C、D、E、F組，每組12只，以用作慢性復(fù)合應(yīng)激的造模。分組后以RBP-1B型無創(chuàng)大鼠血壓測定儀測量每只大鼠的基礎(chǔ)血壓，連續(xù)量3次，取其平均數(shù)作為大鼠造模前的血壓值。自實驗第2周起，造模(B、C、D、E、F)組大鼠分別放在RBP-1B型無創(chuàng)大鼠血壓測定儀自帶的電刺激箱中，以低壓、低頻交流電電擊造模組大鼠足底且結(jié)合100dB的噪音進(jìn)行同步刺激。刺激的電源強度以對大鼠不造成損傷，但引起其強烈反應(yīng)為準(zhǔn)。具體操作方法如下：造模(B、C、D、E、F)組大鼠于每天的上午9∶00～11∶00時及下午3∶00～5∶00時各接受應(yīng)激刺激，總共電刺激14d。第1周：大鼠電刺激強度為40V[2、3]，刺激頻率為2Hz，且結(jié)合100dB的噪音進(jìn)行同步刺激。每次于電刺激箱中放入3只大鼠進(jìn)行電刺激，造模組60只大鼠總共分20批，每隔40min刺激2min，持續(xù)2.00 h，即上、下午每只大鼠各刺激3次；第2周：電刺激強度50V[2、3]，大鼠電刺激的頻率、刺激持續(xù)的時間和噪音分貝同前，同步刺激，上下午分別進(jìn)行。大鼠進(jìn)行刺激的過程中，噪音源置放于電刺激箱的外面，不與大鼠直接產(chǎn)生接觸。

制備的高脂乳劑按照1mL/100g的標(biāo)準(zhǔn)，在慢性復(fù)合應(yīng)激造模過程的第8天起，造模組大鼠在復(fù)合刺激的基礎(chǔ)上開始給予高脂乳劑灌胃，連續(xù)10d[4]。

2.1.2 高血壓大鼠造模成功判定標(biāo)準(zhǔn):參照王秀卿等的應(yīng)激性高血壓判定標(biāo)準(zhǔn)，造模2周后測量大鼠的平均收縮壓(SBP)，造模后大鼠血壓與造模前大鼠血壓的差值升高大于或等于20mmHg(1mmHg=0.133kPa)[2]，并且高于115mmHg[5]者，即可以確定為高血壓疾病造模成功。

2.1.3 實驗動物分組:實驗慢性復(fù)合刺激造模的第8天，造模組中一只大鼠在相互廝打中被咬死，復(fù)合刺激造模的第14天(高脂灌胃第7天)，造模組一只大鼠發(fā)生急性腦梗塞，其右側(cè)肢體活動不遂，發(fā)病第2日即死亡。造模組存活的大鼠中有5只高血壓造模不達(dá)標(biāo)，另有3只大鼠肝熱痰瘀癥狀不達(dá)標(biāo)，造模組大鼠符合造模成功標(biāo)準(zhǔn)的共50只。再次將肝熱痰瘀型高血壓造模成功的大鼠隨機分為模型組、西藥組、中藥大、中、小劑量組各10只。

2.1.4 給藥及喂養(yǎng)方式:自實驗第25天起各實驗組大鼠均開始給予灌胃給藥，1次/d，均在下午進(jìn)行。每只動物按體重計算用量(1mL/100g)?？瞻捉M和模型組大鼠灌0.9%生理鹽水，西藥組灌卡托普利溶液(0.335mg/mL[6])，中藥組灌腦清通顆粒混懸液，大、中、小劑量的配制分別為1.03g/mL，0.69g/mL， 0.34g/mL[6]，療程為3周。實驗期間，各組大鼠均自由飲水。

2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測 2.2.1 血壓測量：采用大鼠無創(chuàng)尾動脈測壓法。

2.2.1.1 慢性復(fù)合應(yīng)激造模期間大鼠血壓的測量:于實驗的前3天使所有大鼠均適應(yīng)測量血壓的過程。在施以應(yīng)激刺激的前1天和應(yīng)激刺激的第4、8、11天及復(fù)合應(yīng)激結(jié)束后1d，用無創(chuàng)大鼠尾動脈測壓儀測量實驗大鼠的血壓。每次測量均在同一時間(上午11：00時) 測量大鼠血壓。每次測量時將4只清醒大鼠置于固定籠中，放入RBP-1B型大鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)內(nèi)，使鼠尾穿過尾套，尾套和換能器相連接，36℃預(yù)熱至10～15min，待大鼠尾動脈充分?jǐn)U張后，將尾套加壓，直至脈搏信號完全消失后，再緩慢放氣至其脈搏信號恢復(fù)正常。應(yīng)用RBP-1B型大鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)自帶軟件，可以測量大鼠實時收縮壓，連續(xù)測量3次，取其平均值。

2.2.1.2 藥物灌胃期間大鼠血壓的測量:每周測一次，每次亦均在同一時間(上午11：00時)測量大鼠血壓。具體測量血壓的方法同前。

2.2.2 取血:藥物灌胃的第3周末，最后一次灌胃給藥后予6h禁食，不禁水。大鼠均在麻醉的狀態(tài)下進(jìn)行實驗。以10%的水合氯醛，按3mL/100g (300mg/Kg)[7]劑量標(biāo)準(zhǔn)行大鼠腹腔注射麻醉，將實驗大鼠仰臥位置于操作臺，使大鼠身體保持自然狀態(tài)，胸廓不要扭曲，在胸部左側(cè)行切口剪開皮膚，分離其胸部的臟器，暴露出心臟，用10mL一次性注射器針管配一次性6號注射器針頭，取其右心室血液，每只大鼠取血大約8 m1，將其中2mL血液沿管壁緩慢注入至含有20μL的0.30M EDTA(乙二胺四乙酸鐵鈉)、20μL的0.34M8-羥基喹啉硫酸鹽和10μL的0.32M二巰基丙醇的抗凝試管中，迅速搖勻后，4℃低溫下離心(3000r/min)15min，然后取上清以備用 ，-20℃保存以測定AngII。另取2mL的血液迅速置于含有30μL的7.5% EDTANa2和40μL的抑肽酶試管中，將其搖勻后，放入冷水浴中進(jìn)行冷卻。離心時，混勻低溫離心4.0℃(3000rpm )，離心5min，分離出血漿后，取其上清液置放于聚丙乙烯塑料試管內(nèi)，以測定ET-1、CGRP。

2.2.3 制備病理切片:大鼠取血完畢后，迅速分離、切取其胸主動脈，取近段(近心臟段)的主動脈5mm，以10%的中性福爾馬林液進(jìn)行固定之后石蠟包埋，切片厚度為4um，并同時對每份切片進(jìn)行標(biāo)記。

2.2.4 病理檢測:常規(guī)HE染色，電子光鏡下觀察主動脈管壁內(nèi)膜及中膜的形態(tài)變化。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)的分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。成組設(shè)計多個樣本均數(shù)進(jìn)行比較時采用單因素方差統(tǒng)計分析，進(jìn)行組間比較時應(yīng)用t檢驗，數(shù)據(jù)檢驗水準(zhǔn)P<0.05時為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果與分析 3.1 大鼠血壓的檢測結(jié)果值 3.1.1 復(fù)合應(yīng)激造模期間大鼠血壓

表1 復(fù)合應(yīng)激造模期間大鼠血壓值(±s)

注：大鼠正常血壓，不麻醉，收縮壓93(82-120)mmHg。與復(fù)合應(yīng)激造模前比較▲P<0.01，△P<0.05；與空白組比較◆P<0.05，◇P<0.01

從表1可看出大鼠血壓變化：應(yīng)激前大鼠平均收縮壓為90mmHg左右，應(yīng)激過程的第4 d造模組大鼠血壓明顯上升，基本為110 mmHg左右，至第8天明顯上升至124 mmHg左右，第11日及第15日雖較前略有上升，但基本趨于平穩(wěn),提示已發(fā)展為應(yīng)激性高血壓。空白組大鼠血壓未見明顯變化。

3.1.2 腦清通混懸顆粒對高血壓大鼠血壓影響

表2 腦清通混懸顆粒對高血壓大鼠血壓影響的變化(±s/mmHg)

注：與治療前比較△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較◆P<0.05，◇P<0.01

從表2可以看出：腦清通混懸顆粒各劑量組均具有抑制大鼠血壓升高的趨勢。灌胃給藥2周后，腦清通混懸顆粒各劑量組均產(chǎn)生明顯的降壓效果，與治療前及模型組比較，具有顯著差異(P<0.01或P<0.05)，且降壓效果于給藥第3周后達(dá)到高峰。

3.2 大鼠血管活性肽的檢測結(jié)果

表3 腦清通混懸顆粒對高血壓大鼠血管活性肽的影響

注：與空白組比較▲P<0.01，△P<0.05；與模型組比較◆P<0.05，◇P<0.01

從表2可以看出：模型組、西藥組及中藥各劑量組內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ含量均明顯高于空白組，而降鈣素基因相關(guān)肽含量均明顯低于空白組，有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)，說明了高血壓大鼠存在血管壁內(nèi)皮的受損導(dǎo)致其分泌及釋放血管活性多肽的功能紊亂，進(jìn)而造成血管舒-縮功能的失衡，血壓升高的病理；而中藥各劑量組較模型組內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ含量降低，降鈣素基因相關(guān)肽含量升高，具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)，說明腦清通混懸顆粒具有調(diào)節(jié)血管舒-縮活性多肽各指標(biāo)水平，保護(hù)血管內(nèi)皮功能以達(dá)到間接降低血壓的作用。

3.3 大鼠胸主動脈光鏡下觀察結(jié)果 由以下各組圖片可以看出：空白組主動脈血管內(nèi)膜光滑，內(nèi)膜為疏松纖維結(jié)締組織，管壁內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊有序，未見異常改變。模型組血管壁內(nèi)膜水腫，膠原纖維、平滑肌組織增生，并見有脂紋，甚至有的出現(xiàn)混合斑塊，均提示實驗大鼠在高血壓病的基礎(chǔ)上以出現(xiàn)了動脈粥樣硬化。西藥組及中藥各劑量組經(jīng)藥物灌胃干預(yù)后其血管壁均有不同程度地改善，但中藥大、中劑量組血管壁的改變最明顯。證明腦清通混懸顆粒可以改善血管彈性，保護(hù)血管內(nèi)皮，具有抗動脈粥樣硬化的作用,見圖1。

4 討 論 高血壓病是嚴(yán)重危害人類身體健康的流行病之一，在全球都有很高的發(fā)病率，且高血壓是心腦血管疾病最重要的危險因素?，F(xiàn)在越來越多的研究資料顯示，目前高血壓病患者多存在著血管舒縮功能的調(diào)節(jié)異常，而血管活性多肽對血管舒縮功能的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用。高血壓病與血管管壁硬化致血管舒縮功能受限程度呈線性相關(guān)，而引起血管壁彈性減退的因素當(dāng)中，血管活性多肽的調(diào)節(jié)血管舒-縮功能失常而引起的心血管重塑作用，成為促發(fā)高血壓病及動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生與進(jìn)展的重要因素[8，9]。

ET-1廣泛地存在于機體各種組織與細(xì)胞內(nèi)，為一內(nèi)源性長效的血管收縮調(diào)節(jié)因子，其具有非常強大的正性肌力作用，是至今為止發(fā)現(xiàn)的效力最強的血管收縮調(diào)節(jié)因子。且有研究發(fā)現(xiàn)，ET的升高和患者的血壓水平以及其靶器官受損的程度呈正相關(guān)，提示了ET不僅參與高血壓病的啟動步驟，亦在高血壓病的維持及并發(fā)癥的發(fā)生中起著非常重要的作用。AngⅡ為RAAS中最強的血管活性物質(zhì)，具有非常強烈的收縮血管的作用，直接使動脈平滑肌產(chǎn)生收縮，增加外周阻力。AngⅡ能增加交感神經(jīng)沖動的發(fā)放，增加醛固酮的分泌，加強體內(nèi)的水鈉潴留。AngⅡ還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與VSMC的肥大、增殖，進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展，導(dǎo)致血管壁的重塑，增加血管阻力，甚至發(fā)展為左心室肥厚等，在整個高血壓病的發(fā)生與發(fā)展的過程中起著非常重要的作用。CGRP廣泛地分布在心血管系統(tǒng)中，為機體中作用最為強烈而持久的舒血管活性多肽。臨床及實驗研究中發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性高血壓病者和自發(fā)性高血壓大鼠的血漿中CGRP濃度的降低，被作為血壓升高的重要原因。而在繼發(fā)性的高血壓病者(例如醛固酮增多癥)以及兩腎一夾型高血壓大鼠血漿中的CGRP濃度的增高，被認(rèn)為機體為了抵抗血壓的升高作出的有益代償。外源性給予CGRP亦可以降低血壓。CGRP能夠強烈地舒張血管，使血壓降低，增加機體的血流量，抑制血小板的凝集，抑制VSMC的增殖等以對抗組織的損傷，起到保護(hù)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的重要作用。

圖1 大鼠胸主動脈光鏡下觀察結(jié)果

高血壓病屬于中醫(yī)學(xué)的“眩暈”、“頭痛”范疇，其基本病機為肝腎陰虛，肝陽上亢，痰瘀內(nèi)阻?，F(xiàn)在大量研究資料提示高血壓病不同分型的患者中其血管活性肽水平亦有明顯區(qū)別，并將血管內(nèi)皮功能損傷視為肝腎陰虛證的病理生理基礎(chǔ)[10]。腦清通混懸顆粒由草決明、丹參、姜半夏等藥物組成，具有平肝潛陽、化痰通絡(luò)之功效。根據(jù)中藥藥理分析，草決明具有顯著地降低血壓、抗動脈粥樣硬化、改善腦部血液供應(yīng)及鎮(zhèn)靜的作用，且其還可以調(diào)節(jié)機體膽固醇水平，保護(hù)血管內(nèi)皮，改善血管彈性的作用。丹參有效成分可以擴張冠脈血管，降低血壓，提高冠脈血流量；亦可以改善血液流變性，降低血漿粘度，抗血小板凝集；此外，其還可以調(diào)節(jié)血脂，抗動脈粥樣硬化。姜半夏具有顯著地鎮(zhèn)咳，且其還可降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白而具有調(diào)節(jié)血脂的作用。本文以血壓、ET、CGRP、AngⅡ作為觀察指標(biāo)，探討腦清通混懸顆粒對上述指標(biāo)的影響。

通過實驗證明腦清通混懸顆粒對高血壓模型大鼠的血壓、ET、CGRP、AngⅡ均有明顯改善，且其作用明顯優(yōu)于卡托普利組。說明腦清通混懸顆粒大、中、小三個劑量均有降低血壓及調(diào)節(jié)血管活性肽水平以維持整個血管張力控制系統(tǒng)穩(wěn)定的作用，且中劑量為最佳劑量，建議臨床應(yīng)用。

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(收稿2014-10-11；修回2014-11-08)

*陜西省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)項目(12JK1022);

高血壓/中西醫(yī)結(jié)合療法 @腦清通混懸顆粒 動物，實驗 大鼠

R743.3

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.059

咸陽市科技局課題(2012k16-01-09)

△山東省肥城市老城街道衛(wèi)生院(肥城 271601)