西安市中心醫(yī)院(西安710003)

孫 艷 杜方雄△

·臨床檢驗(yàn)·

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)法在青春期少兒活動(dòng)性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用*

西安市中心醫(yī)院(西安710003)

孫 艷 杜方雄△

目的:評(píng)價(jià)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)在青春期少兒活動(dòng)性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法：收集青春期活動(dòng)性結(jié)核病患者52例，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)，并與病理檢測(cè)、結(jié)核PCR、痰涂片、結(jié)核抗體檢查結(jié)果相對(duì)比。結(jié)果：結(jié)核病患者中ELISPOT敏感性94.9 %，而病理診斷、PCR、痰涂片、結(jié)核抗體檢查的陽性率分別為61.1%、12.1%、19.1%、12.0%，顯著高于其它輔助檢查方法。結(jié)論：ELISPOT檢查靈敏、快速，適宜作為青春期少兒結(jié)核病診斷的重要輔助工具。

近年來一種新型的診斷技術(shù)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)在成人結(jié)核病診斷中的作用得到了人們的認(rèn)可。但該方法在青春期少兒結(jié)核病感染中的診斷作用如何少見報(bào)道。本研究對(duì)青春期結(jié)核病少兒做了ELISPOT檢測(cè)，并與臨常用的其他結(jié)核病的輔助檢查進(jìn)行比較，探討了該方法在青春期少兒結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 選取西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年1月至2014年12月收治的9～18歲青春期活動(dòng)性結(jié)核病患者52例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《諸福堂實(shí)用兒科學(xué)》第7版。女11例，男41例，平均年齡16.7 歲;最終診斷肺結(jié)核7例，結(jié)核性胸膜炎18例，結(jié)核性腹膜炎、結(jié)核性腦膜炎、腸結(jié)核及腎結(jié)核合并膀胱結(jié)核各1例。

2 試驗(yàn)方法 患者入院后行病理檢測(cè)、結(jié)核聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、痰涂片抗酸染色、結(jié)核抗體檢查及ELISPOT檢測(cè)。ELISPOT檢測(cè)使用TSPOT-TB(英國Oxford Immunotec Let)試劑盒。

ELISPOT操作方法：①采集患者外周靜脈血3～4ml，肝素抗凝，于6h內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn) ②Ficoll液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105個(gè)/ml，加入預(yù)包被INF-γ抗體的96孔微孔板里，每份4個(gè)孔; ③加入抗原:分別加入植物血凝素PHA、 抗原A(ESAT-6)、抗原B(CFP-10)、細(xì)胞培養(yǎng)液，分別作為陽性對(duì)照陰性、兩種實(shí)驗(yàn)抗原及陰性對(duì)照。 ④溫箱培養(yǎng) 24 h; ⑤PBS洗板4次，加入生物素標(biāo)記的二抗;⑥加入親合素標(biāo)記的酶結(jié)合物,使底物顯色,在細(xì)胞因子分泌的地方形成斑點(diǎn); ⑦結(jié)果判斷:用計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀與統(tǒng)計(jì)。陽性對(duì)照孔如出現(xiàn)斑點(diǎn)，說明試驗(yàn)成功。當(dāng)測(cè)試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果：① 如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6。② 如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)必須≥2倍的陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，多組之間率的比較進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，配對(duì)資料進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ELISPOT試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的敏感性評(píng)價(jià) 結(jié)核病患者中，ELISPOT方法檢測(cè)的陽性率為94.9%，而病理診斷、PCR、痰涂片、結(jié)核抗體檢查的陽性率分別為61.1%、12.1%、19.1%、12.0%，ELISPOT陽性率顯著高于其它輔助檢查(P<0.05)，見表1。部分PCR的檢測(cè)用血標(biāo)本檢測(cè)為陰性，而在肺泡灌洗液中檢測(cè)為陽性；其中1例肺結(jié)核患者及1例腎結(jié)核合并膀胱結(jié)核患者ELISPOT試驗(yàn)為陰性。

表1 ELISPOT與其它各種方法檢查陽性率比較

2 ELISPOT與結(jié)核PCR試驗(yàn)的一致率和敏感度 在25例活動(dòng)性青春期結(jié)核病患者中，同時(shí)做了ELISPOT與PCR試驗(yàn)，該兩種方法的一致率為12%，其中20例患者PCR方法檢測(cè)陰性，但ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)陽性，ELISPOT敏感率為92%，PCR敏感率為12%，經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

3 ELISPOT與TB-IgG試驗(yàn)的一致率和敏感度 23例結(jié)核患者同時(shí)做了ELISPOT與TB-IgG的檢測(cè)，其中ELISPOT試驗(yàn)的敏感性明顯高于TB-IgG，見表3 。

表2 結(jié)核病少兒的PCR和ELISPOT試驗(yàn)的一致率和敏感度

表3 結(jié)核病少兒PCR和ELISPOT試驗(yàn)一致率和敏感度

討 論

目前青春期少兒結(jié)核病的診斷主要依靠病史、PPD、影像學(xué)檢查、涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核抗體和抗原檢測(cè)、分子生物學(xué)診斷，其中病原學(xué)檢查是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但敏感性太低。

ELISPOT檢測(cè)是一種新型的快速檢測(cè)結(jié)核感染的方法。其原理為將結(jié)核桿菌所特有的兩種抗原ESAT26和CFP10加入受檢者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中進(jìn)行孵化，若該機(jī)體感染了結(jié)核分枝桿菌，則可刺激其中的記憶性T細(xì)胞增殖分化，釋放IFN-γ，計(jì)數(shù)這些細(xì)胞來判別機(jī)體是否感染結(jié)核。據(jù)報(bào)道該方法的敏感度及特異度都很高[1]。但該方法在青春期少兒結(jié)核病診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值如何，少見報(bào)道。本試驗(yàn)比較了青春期結(jié)核病患者的ELISPOT試驗(yàn)、痰涂片結(jié)核菌查找、病理檢測(cè)、結(jié)核抗體及結(jié)核PCR的方法。在本研究中，ELISPOT在青春期少兒結(jié)核病中的陽性率達(dá)94.9%，與其它研究結(jié)果相似[2]。其敏感性顯著高于細(xì)菌學(xué)檢查陽性率(19%)及PCR(12%)、IgG(12%)。有實(shí)驗(yàn)用雙核酸實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌，陽性率(41.4%)高于本試驗(yàn)組[3]，但其水平仍低于ELISPOT方法。本試驗(yàn)中病理學(xué)檢查陽性率高達(dá)61.1%，但因病理學(xué)檢查受其標(biāo)本取材的限制，不能廣泛開展。在本研究中有2例ELISPOT試驗(yàn)陰性，因此ELISPOT方法還需結(jié)合其它臨床資料綜合分析做出臨床診斷。在以后的研究中，隨著樣本量擴(kuò)大后將能看到更多的假陰性結(jié)果，需進(jìn)一步分析影響ELISLPOT方法的原因。

有研究表明在結(jié)核性胸膜炎的診斷中用胸腔積液檢測(cè)ELISPOT的陽性率要高于用外周血的[4]。與此相似的是本試驗(yàn)中部分PCR的檢測(cè)用血標(biāo)本檢測(cè)為陰性，而在肺泡灌洗液中檢測(cè)為陽性，故為提高結(jié)核病診斷，需多次、多部位采取標(biāo)本，尤其是感染部位的PCR更可靠。

可見，ELISPOT方法診斷青春期少兒結(jié)核感染敏感度高于痰涂片檢查、病理檢測(cè)、結(jié)核抗體及PCR的方法，可作為這些患者有價(jià)值的輔助診斷依據(jù)。與其它傳統(tǒng)診斷方法相結(jié)合，可望提高診斷的準(zhǔn)確性。

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[2] Higuchi K, Kawabe Y, Mitarai S,etal. Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection [J]. Medical Microbiology and Immunology, 2009, 198: 33-37.

[3] 劉尚武，梁亞萍，朱 蕾,等.雙核酸實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)在分枝桿菌檢測(cè)中的臨床應(yīng)用[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2014，43(8): 1096-97.

[4] Liao M, Yang Q, Zhang J,etal. Clin Vaccine Immunol. Gamma interferon immunospot assay of pleural effusion mononuclear cells for diagnosis of tuberculous pleurisy[J]. 2014, 21(3):347-53.

(收稿：2015-03-10)

*陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012JM4049)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè) 結(jié)核/診斷 結(jié)核菌素試驗(yàn) 青少年

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A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.067

△通訊作者