西安市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科 (西安 710082 )

鄭 杰 王曉元△ 劉 丹▲ 楊良勤 陳慶平

艾拉莫德(T-614)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡和IL-8趨化因子免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)研究*

西安市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科 (西安 710082 )

鄭 杰 王曉元△劉 丹▲楊良勤 陳慶平

目的：檢測(cè)艾拉莫德(T-614)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)凋亡作用及IL-8細(xì)胞因子水平變化，探討T-614對(duì)RA治療的免疫機(jī)制。方法：收集風(fēng)濕免疫科診斷明確的活動(dòng)期RA患者，采集全血，處理收集PBMC。制備T-614，使用不同劑量T-614，為高劑量組、中等劑量組和低劑量組與PBMC共培養(yǎng)，孵育1h、3h，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC凋亡，并收集上清檢測(cè)IL-8水平。結(jié)果：T-614與PBMC共孵育培養(yǎng)，T-614高劑量、中劑量與空白對(duì)照組PBMC凋亡率為1h:12.30±2.45%、8.23±2.29%和4.71±2.01%，3h：25.47±4.19%、13.39±3.80%和7.88±2.71%，各組比較使用T-614低劑量，中等劑量與PBMC共孵育培養(yǎng)24h收集上清，ELISA法檢測(cè)IL-8水平，T-614中、低劑量與空白對(duì)照組分別為48.91±8.33μg/ml、125.31±20.02 μg/ml和155.36±22.15μg/ml。結(jié)論：隨著T-614濃度升高，對(duì)PBMC細(xì)胞凋亡成劑量依賴(lài)性趨勢(shì)，同時(shí)降低細(xì)胞分泌因子IL-8水平。免疫調(diào)控誘導(dǎo) PBMC凋亡、降低趨化因子IL-8水平可能是T-614治療RA的重要機(jī)制。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎( Rheumatoid arthritis, RA) 是一種進(jìn)行性、侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫疾病，在我國(guó)的患病率為0.2%～0.4%。艾拉莫德(Iguratimod，T-614)一種新型開(kāi)發(fā)的抗風(fēng)濕藥物，治療RA具有高效、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，作為抗風(fēng)濕二線藥在關(guān)節(jié)炎的治療中逐步體現(xiàn)出較佳的療效，但其確切的治療機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)T-614對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)凋亡作用，以及IL-8細(xì)胞因子水平變化，探討T-614對(duì)RA治療的免疫作用機(jī)制。

資料與方法

1 一般資料 收集2013年10月至2014年2月在西安市第五醫(yī)院就診的RA患者12例，男性2例，女性10例，年齡20～65歲，病程2月至10年。診斷均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)修訂的診斷分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，且未使用過(guò)艾拉莫德治療。患者DAS28評(píng)分≥3.2分，為病情活動(dòng)期，患者均簽署知情同意書(shū)。

2 主要試劑和儀器 Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自MP. Biomedicals公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Human IL-8 Immunoassay ELISA試劑盒，購(gòu)自北京盛基瀚森科技有限公司，艾拉莫德(T-614)由先聲藥業(yè)公司惠贈(zèng)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀產(chǎn)自美國(guó)Becton Dickinson公司，酶標(biāo)儀為美國(guó)BioTek公司。

3 方 法 艾拉莫德(T-614)(先聲藥業(yè)公司惠贈(zèng))每片25mg，粉碎后，溶解在2ml的DMSO中，震蕩20min后，過(guò)40μm篩網(wǎng)，配置成10mg/ml，分裝EP管中，細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用DMEM液稀釋10倍使用微孔過(guò)濾器過(guò)濾分裝使用。

3.1 細(xì)胞分組處理：患者靜脈血10ml入肝素抗凝管中，采用密度梯度分離法，分離PBMC后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1ml細(xì)胞混懸液，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。將每例PBMC設(shè)7個(gè)孔進(jìn)行處理：空白對(duì)照組(無(wú)藥物干預(yù))，T-614高劑量組(500μg/ml)、中等劑量組(50mg/ml)，共培養(yǎng)分別為1h和3h，檢測(cè)PBMC凋亡。T-614中等劑量組(50μg/ml)組、T-614低劑量組(5μg/ml)組培養(yǎng)24h，染色進(jìn)行CD3+T 細(xì)胞IFN-γ表達(dá)檢測(cè)及收集上清檢測(cè)IL-8水平。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC的凋亡：分別收集培養(yǎng)箱孵育1h、3h及24h后的培養(yǎng)細(xì)胞，吹打混勻，將細(xì)胞混懸液收集在流式管里，1200r/min，離心8min，收集培養(yǎng)上清液，置于-80℃冰箱備ELISA檢測(cè)。細(xì)胞制備：加入PBS液，1200r/min，離心5min，洗滌2次，棄上清。加入1×Annexin-Binding Buffer液100μl，將細(xì)胞混勻，在暗室內(nèi)冰上操作。每管加4μl Annexin V-FITC和1μl的PI工作液(1∶4稀釋)。室溫，孵育15min。加1×Annexin-Binding Buffer液150μl，輕柔混勻，1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)樣本。

3.3 ELISA檢測(cè)IL-8水平：根據(jù)Human IL-8 Immunoassay ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)：以空白孔設(shè)為零值，以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，以630nm為參考波長(zhǎng)，測(cè)吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品中IL-8的含量。

結(jié) 果

1 T-614干預(yù)PBMC細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 T-614不同劑量干預(yù)PBMC，對(duì)1h、3h干預(yù)的PBMC進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下可見(jiàn)正常PBMC圓形狀態(tài)良好，包膜清晰，臺(tái)盼藍(lán)染色呈蘭色染色為凋亡壞死細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞大小不等，破碎壞死等見(jiàn)圖1。

圖1 與T-614共培養(yǎng)后PBMC臺(tái)盼藍(lán)染色[A:正常對(duì)照組;B:1h空白對(duì)照組(未加T-614)；C：1h中等劑量組(T-614 50μg/ml);D:1h高劑量組(T-614 50μg/ml);E:3h中等劑量組(T-614 50μg/ml)；F：3h高劑量組(T-614 500μg/ml)。×100倍]

2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC凋亡結(jié)果 共孵育1h和3h，凋亡細(xì)胞百分比空白對(duì)照組與T-614高、中等劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T614高與中等劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2、表1。

3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè) ELISA檢測(cè)上清IL-8水平，T-614中等和低劑量組與對(duì)照組比較，IL-8水平明顯減低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 各組PBMC凋亡細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

表2 共培養(yǎng)24h上清各組IL-8結(jié)果的比較 (±s)

討 論

RA是一種慢性的全身自身免疫性病，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)特異的有效治療方法。艾拉莫德(T-614)為新型的口服的小分子DMARDs藥物，在RA疾病中的治療作用越來(lái)越受到重視[1]。多項(xiàng)研究表明，由于RA患者自身免疫功能紊亂，自身淋巴細(xì)胞過(guò)度增生激活本文采用RA的PBMC進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，T-614可以誘導(dǎo)RA患者PBMC凋亡，且呈劑量依賴(lài)性，提示T-614對(duì)患者淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。從而減輕誘導(dǎo)疾病加重的全身及關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)，改變了病程，與以往的臨床治療療效觀察結(jié)果相符[2]。

活化的淋巴細(xì)胞分泌IL-8等是重要的免疫炎癥因子，在RA的發(fā)病中起到非常重要的作用，IL-8是多形核中性粒細(xì)胞有效的趨化因子，能增加人單核細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的釋放，趨化包括TNF-、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子，可以進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，激活粒細(xì)胞發(fā)生變形、游走和聚集，在炎癥部位產(chǎn)生浸潤(rùn)作用。本研究得出，隨著T-614劑量增加，PBMC上清的IL-8水平逐步下降，提示了T-614有抑制PBMC分泌IL-8的作用，且呈濃度依賴(lài)性，故考慮經(jīng)T-614治療后，患者血清中IL-8水平可能減低，炎性趨化能力減弱，具有減輕患者全身關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的治療作用。上述研究結(jié)果提示，T-614治療RA的免疫抑制可能為誘導(dǎo)了活動(dòng)期RA患者PBMCs的凋亡，抑制細(xì)胞因子IL-8分泌，而達(dá)到改善癥狀，控制病情的作用。

[1] Mucke HAM. Iguratimod: A new disease-modifying antirheumatic drug[J]. Drugs of Today,2012, 48(9): 577.

[2] 劉 丹，陳 妤，丁漢飛，等.艾拉莫德(T-614)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床療效的研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2013，22(9):1052-1055.

(收稿：2015-01-13)

The effects of Iguratimod(T-614) on the apoptosis of peripheral blood mononuclear cells and the secretion of IL-8 in rheumatoid arthritis patients

Department of Rheumatology, The Fifth Hospital of Xi’an (Xi'an 710082)

Zheng Jie Wang Xiaoyuan Liu Dan et al

Objective:To observe the effect of Iguratimod (T-614) on the apoptosis of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the expression of IL-8 in rheumatoid arthritis (RA) patients, and to explore the possible mechanism of T-614 in treating RA. Methods: 12 patients were diagnosed with RA referred to the Department of Rheumatology. PBMCs were prepared from 12 patients in active stage of RA and treated with T-614 at different concentrations (lower dose: 5 μg/ml; Moderate dose: 50 μg/ml; Higher dose: 500μg/ml ) for 1h and 3h Flow cytometry (FCM) were performed to examine the apoptosis of PBMCs.the secretion of IL-8 in the culture supernatant of treatment group and control group was tested by ELISA after treated with T-614 for 24h. Results: We found that iguratimod effectively induced apoptosis in PBMCs. The apoptosis rates of PBMCs treated with T-614 for 1h were T-614 8.23±2.29% for 50 μg/ml and 12.30±2.54% for 500 μg/ml. The apoptosis rates of PBMCs treated with T-614 for 3h were 13.39±3.80% for 50 μg/ml and 25.30±4.19% for 500 μg/ml. Levels of IL-8 in the culture supernatant of T-614 treated group and control group were tested by ELISA. Iguratimod effectively inhibit IL-8 prodcution, 48.91±8.33 μg/ml for T-614 50 μg/ml, 125.31±20.02μg/ml for T-614 5 μg/ml and 155.36±22.15 μg/ml for the control group (treated without T-614).Conclusions: The results suggest that T-614 induced the apoptosis of PBMCs and inhibited the secretion of IL-8 in peripheral blood. It might be the possible mechanism of the effect of T-614 in treatment of RA.

Arthritis rheumatoid/immunology Apoptosis Monocytes Chemotactic factor IL-8

*陜西省衛(wèi)生廳科研資助項(xiàng)目(2012D25)

甘肅省科技廳資助項(xiàng)目(144FKCA060)

關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕/免疫學(xué) 細(xì)胞凋亡 單核細(xì)胞 趨化因子類(lèi) 白細(xì)胞介素-8

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.007

△蘭州大學(xué)第二醫(yī)院

▲通訊作者