西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科·教育部環(huán)境與疾病相關(guān)基因重點實驗室(西安 710061)

韓 克 劉 昱 李 濤△ 馬愛群 董安平 吳格如 席羽濤

·論著·基礎(chǔ)研究·

無輔助呼吸大鼠心肌梗死模型的制備*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科·教育部環(huán)境與疾病相關(guān)基因重點實驗室(西安 710061)

韓 克 劉 昱 李 濤△馬愛群 董安平 吳格如 席羽濤

目的： 建立簡單、有效的大鼠心肌梗死模型，不用氣管插管和呼吸機(jī)，直接開胸，在直視下結(jié)扎冠狀動脈，制備大鼠心肌梗死模型。方法：不用氣管插管和呼吸機(jī)，經(jīng)胸骨左緣切口開胸，保持胸膜腔完整，縫扎左室支。術(shù)后6周，做病理檢查，明確梗死存在并測量梗死面積。結(jié)果：大鼠圍手術(shù)期死亡率23.1%,與假手術(shù)組相比，6周后冠脈結(jié)扎組左室增大，左室收縮舒張功能受損，病理檢查示心肌梗死存在，梗死面積平均為26.6%，兩組大鼠心肌梗死面積有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：本法成功建立了大鼠心肌梗死模型，具有簡便、實用、成功率高之特點；大鼠可作為有關(guān)心肌梗死臨床研究模型所用合適動物。

直接縫扎冠狀動脈前降支或旋支是制備心肌梗死動物模型的常用方法。基于不同的實驗條件和目的，研究者選用不同的動物如：豬、狗、兔、鼠等。由于狗心臟預(yù)成的側(cè)枝循環(huán)較多，會影響心肌梗死后某些干預(yù)結(jié)果的評估；鼠心臟與人相似，是理想的實驗動物，因此，可作為有關(guān)心肌梗死臨床研究模型所用適合動物[1]。但以往大鼠心梗模型的制備需要使用呼吸機(jī)且死亡率較高，由于很多單位無動物呼吸機(jī)等設(shè)備，致使許多地方無法制備大鼠心梗模型。本實驗在既往心肌梗死動物模型的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，不使用動物呼吸機(jī)，直接開胸結(jié)扎大鼠冠狀動脈制備心梗模型。從而建立了一種簡單、有效和實用的制作大鼠急性心肌梗死模型的方法，并降低了心梗大鼠模型的死亡率。

材料與方法

1 實驗動物及模型制作 將成年健康雄性SD (Sprague-Daw ley) 大鼠(體重250～300g)20只隨機(jī)分為冠脈結(jié)扎組(MI)14只和假手術(shù)組(6只)，采用乙醚麻醉后，腹腔注射利多卡因(1mg/kg)，以預(yù)防冠狀動脈結(jié)扎后突發(fā)室顫死亡。本研究不用氣管插管和呼吸機(jī)，保持大鼠于自然呼吸狀態(tài)，仰臥位固定于手術(shù)臺，剪除胸前區(qū)毛，碘氟消毒，沿胸骨左緣切口，觀察心尖搏動部位，于心尖搏動最明顯的肋間鈍性分離肋間肌，暴露心臟，用棉簽輕輕將心臟向右上抬起，即可充分顯露左冠狀動脈前降支，于左心耳下約1mm處用6-0縫線縫扎左冠狀動脈。左心室前壁及心尖部顏色變暗，搏動減弱，表明左冠狀動脈前降支完全結(jié)扎，然逐層關(guān)胸。腹腔推注10萬U青霉素。假手術(shù)組左冠狀動脈前降支下心肌縫線，但不結(jié)扎，其余同冠脈結(jié)扎組。整個手術(shù)過程約3～5min。術(shù)后6周心電圖檢查示冠脈結(jié)扎組相關(guān)導(dǎo)聯(lián)均存在病理性Q波，而假手術(shù)則無；超聲心動圖觀察手術(shù)組心臟明顯增大，室壁運動幅度減低，假手術(shù)組無上述改變，證明模型成功。

2 心動超聲檢查 術(shù)后6周，將大鼠在清醒狀態(tài)下仰臥固定于自制的檢查板上，暴露胸部，靜臥5min后開始用心動超聲檢查，用M型超聲心動圖方法記錄左心室收縮和舒張期運動曲線，分別測量左室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)和舒張末期內(nèi)徑(LVDD)及RR間期。

3 梗死面積測量 測完左心室壓力數(shù)據(jù)后，經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)注射肝素1000 U及30mmol/L氯化鉀使心臟停于舒張期，開胸取出心臟，生理鹽水沖洗，修剪后將心臟橫切成6個厚片，取出與超聲切面心臟短軸乳頭肌水平相對應(yīng)的厚片，浸入37oC氯化三苯四氮唑(TTC)液中20min染色，參照文獻(xiàn)[2]測量環(huán)向心肌的總面積(TA)及TTC染色顯示壞死的面積(A)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。相關(guān)性采用相關(guān)分析的方法檢驗，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 大鼠存活率 除麻醉死亡1只外，其余13只大鼠均進(jìn)行冠脈結(jié)扎，圍手術(shù)期死亡3只(術(shù)后1h、12h、24h時各死亡1只)，死亡率為23.1%。觀察過程中3只大鼠又分別在第4、9天死亡，尸檢除左室前側(cè)壁梗死外見心包、胸腹腔積液，心臟擴(kuò)大明顯。提示大鼠死于急慢性心力衰竭。僅8只 (61.5%)存活至實驗終點。6例假手術(shù)組大鼠均存活。冠脈結(jié)扎組和假手術(shù)組平均觀察43 ± 5d。

2 心動超聲檢查結(jié)果 見附表和圖1。冠脈結(jié)扎組左心室擴(kuò)大，前側(cè)壁變薄，運動減弱且僵硬，心包腔積液(箭頭所示)。心梗組較對照組左室舒張末內(nèi)徑和收縮末內(nèi)徑分別增加53.4%，83.8%(P<0.01)。

附表 冠脈結(jié)扎組和假手術(shù)組大鼠心動超聲測量參數(shù)±s)

注：與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01

圖1 左室短軸舒張期成像及M超心動圖 A，B為假手術(shù)組；C，D為冠脈結(jié)扎組

3 梗死面積及其相關(guān)性 見圖2。心臟大體觀察示：假手術(shù)組無心肌梗死；心肌梗死組左冠狀動脈前降支結(jié)扎部位以下，見沿前降支走行左室心肌呈灰白色，條形分布，形狀不規(guī)則, 梗死灶主要在左室前側(cè)壁及心尖部, 且均為透壁性壞死。 乳頭肌水平梗死面積平均為36.7%(28.8%～49.3%)，心肌梗死面積與左室內(nèi)徑相關(guān)(LVDD,r=0.957,P<0.01; LVSD,r=0.887,P<0.05)。

圖2 正常大鼠HE染色切片(A)與心梗大鼠HE染色切片(B)對照

討 論

心肌梗死動物模型的制作方法較多，大致分為兩類：一是開胸法，如：冠脈結(jié)扎法、冠脈夾閉法、微量直流電刺激法、化學(xué)灼燒法等；二是閉胸法，通過注射藥物如異丙基腎上腺素、阿霉素等使心肌細(xì)胞壞死。而開胸結(jié)扎冠狀動脈較為直觀，接近急性心梗的生理狀況，且結(jié)扎后梗死部位恒定，個體差異小，模型有較強(qiáng)的代表性和說服力，是急性心梗模型的經(jīng)典制作方法。本實驗結(jié)扎大鼠冠脈左室支后，經(jīng)血流動力學(xué)及心動超聲檢查顯示：大鼠心功能下降，且病理檢查證實心肌梗死存在，提示成功建立了大鼠心肌梗死模型。

傳統(tǒng)心梗動物模型制作的缺點：①需進(jìn)行氣管插管和應(yīng)用呼吸機(jī)，操作繁瑣，且對手術(shù)技能、實驗條件要求較高；②在造模時打開了胸膜腔，影響呼吸及血流動力學(xué)；③顯露將要縫扎的左室支，需將心尖抬起或?qū)⑿呐K牽出胸腔外；④手術(shù)時間較長，術(shù)后恢復(fù)慢；⑤對插管技術(shù)要求較高，較難掌握；⑥氣管插管對動物有不同程度的損傷，不利于恢復(fù)。魏峰等報道：傳統(tǒng)心梗動物模型制作圍手術(shù)期大鼠死亡率極高，尤其是小動物可高達(dá)50%[3～6]。無輔助呼吸大鼠心肌梗死模型制備具有的優(yōu)點：①無須氣管插管，保持大鼠的自然呼吸，避免了氣管插管時對呼吸道的損傷。②心臟于原位，即可充分顯露左冠狀動脈前降支，加之結(jié)扎前腹腔注射利多卡因，減少了室顫的發(fā)生；③手術(shù)時間短，整個實驗過程僅需要2～3min；④對實驗條件要求不高，避免了氣管插管對動物的損傷。

總之，無輔助呼吸大鼠心肌梗死模型制備法操作簡單，手術(shù)時間短，并發(fā)癥少，大鼠圍術(shù)期死亡率低，整體上提高了大鼠的成活率。

[1] Leor J,Tuvia S,Gueta V,etal.Intracoronary injection of in situ forming alginate hydrogel reverses left ventricular remodeling after myocardial infarction in swine[J] .J Am Coll Cardiol,2009,54(11):1014- 1023.

[2] 成官迅， 張雪林，劉伊麗. 急性心肌梗死后危險區(qū)與梗死區(qū)的識別[J]. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2002，18(11)：1098-1099.

[3] 魏 峰，張 靜，韓 克，等. 非人工通氣下大鼠急性心肌梗死模型的建立[J] . 西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，31(6)：699- 702.

[4] Peukert D,Laule M,Kaufels N,etal. Aminimally invasive method for induction of myocardial infarction in a animal model using tungstem spirals[J] . Int J Cardiovasc Imaging,2009,25(5):259-535.

[5] 董安平,韓 克，馬愛群.兔心肌梗死模型的建立及心功能的超聲評價[J]. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2003 ，19(8)：964-966.

[6] 張潤峰,王繼生.建立大鼠心肌梗死模型的若干問題探討[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2004 ，35 (1)：13-15.

(收稿：2015-01-20)

To develop a rat model of myocardial infarction without assistant ventilated

Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital of Medical College,Xi’an Jiaotong University(Xi’an710061)

Han Ke Liu Yu Li Tao et al

Objective: To develop a new model of myocardial infarction The rat was not intubated and not ventilated using a animal ventilator. Methods: The rat was not intubated and not ventilated using a animal ventilator. A thoracotomy was performed along left sternum with pleura cavity integrity. The major ventricular branch of the left coronary artery was ligated 1-2mm under the left atria. Sham-operated rats served as controls. Results: Perioperative mortality of rats with myocardial infarction was 23.1%. Six weeks after , echocardiography suggests that the coronary ligation groups had significantly more dilated left ventricles with lower EF、FS than the control group(P<0.05). The infarcted area in the coronary ligation animals was nearly always transmural , the total infarct area ranged from 19 to 38% and there were significant correlations between infarct size and left ventricular impairment as assessed by ejection fraction, left ventricular dimension (P<0.05).Conclusion: We constituted a simple, rapid, and effective method of producing myocardial infarction in rat;rat can be used as a appropriate myocardial infarction model in clinical reaserch.

Myocardial infarction/pathology Myocardial infarction/therapy Model,animals Rats @Without assistant ventilated

*陜西省科技攻關(guān)項目(2012K15-01-01)

心肌梗塞/病理學(xué) 心肌梗塞/治療 模型，動物 大鼠 @無輔助呼吸

R542.22

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.001

△西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科