杜慶紅 徐 雅 李衛(wèi)紅 狄 波 李雅潔

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

實(shí)驗(yàn)研究

腦復(fù)明滴丸對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

杜慶紅 徐 雅 李衛(wèi)紅 狄 波 李雅潔

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：探討腦復(fù)明滴丸對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎建立血管性癡呆模型，以安理申作為陽性對(duì)照藥物。60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦復(fù)明滴丸高劑量組、腦復(fù)明滴丸中劑量組、腦復(fù)明滴丸低劑量組、陽性藥對(duì)照組。采用Morris水迷宮試驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果：在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，腦復(fù)明滴丸可顯著縮短總路程與逃避潛伏期，并且顯著延長癡呆大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間。在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，腦復(fù)明滴丸能夠顯著縮短癡呆大鼠的潛伏期。結(jié)論：腦復(fù)明滴丸對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能有改善作用。

腦復(fù)明滴丸；血管性癡呆；學(xué)習(xí)記憶

腦復(fù)明滴丸是基于中醫(yī)“毒損腦絡(luò)”的病機(jī)理論，由梔子、三七有效部位制成的現(xiàn)代中藥。前期研究顯示，采用海馬注射Aβ的擬AD大鼠模型以及APPV717I轉(zhuǎn)基因小鼠模型，三七和梔子有效成分均能夠明顯改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[1]。在APPV717I轉(zhuǎn)基因小鼠模型，預(yù)防性用藥和早期用藥，三七和梔子有效成分對(duì)學(xué)習(xí)和記憶能力都有很好的改善作用[2]。本研究通過大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎造成血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)模型，觀察腦復(fù)明滴丸對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD大鼠60只，按照隨機(jī)的原則，分成假手術(shù)組、模型組、腦復(fù)明高劑量組、腦復(fù)明中劑量組、腦復(fù)明低劑量組、陽性藥對(duì)照組(安理申)，每組10只。術(shù)后15 d給藥組動(dòng)物灌服不同劑量的腦復(fù)明滴丸(浸膏)，早晚各1次，共治療30 d；假手術(shù)組和模型組給予同等劑量的生理鹽水灌服；陽性對(duì)照組灌服安理申。

1.2 模型制作 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，固定，頸正中縱行切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用1號(hào)絲線行永久性結(jié)扎。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其他處理同模型組。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

1.3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 參照Morris實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。大鼠在完成給藥時(shí)程后，適應(yīng)性游泳90 s。具體方法如下：每只大鼠每次測(cè)試時(shí)間為90 s。測(cè)試前先將動(dòng)物放置在平臺(tái)上適應(yīng)10 s，令其進(jìn)行空間定位。然后，將大鼠分別從未放置平臺(tái)的三個(gè)象限輕放入水，并記錄大鼠入水后90 s的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。將大鼠從入水至找到平臺(tái)所需時(shí)間定義為逃避潛伏期，記錄大鼠逃避潛伏期及在逃避潛伏期時(shí)間內(nèi)大鼠游泳總路程。若大鼠在規(guī)定90 s時(shí)間內(nèi)能夠找到平臺(tái)，并在平臺(tái)停留超過5 s者視為尋臺(tái)成功，其潛伏期則為實(shí)際尋臺(tái)所用時(shí)間；若大鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，視為尋臺(tái)失敗，其潛伏期設(shè)定為90 s。此外，如果大鼠90 s內(nèi)不能找到平合則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引大鼠到平臺(tái)上停留10 s，再放回到籠中。每只動(dòng)物測(cè)試完一個(gè)象限后休息3 h再進(jìn)行下一次測(cè)試。每只動(dòng)物測(cè)試3次/d。前3 d為適應(yīng)性訓(xùn)練，第4天進(jìn)行大鼠逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。每天動(dòng)物測(cè)試順序、入水象限、測(cè)試時(shí)段保持一致。空間探索實(shí)驗(yàn)：待連續(xù)4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后，于第5天，撤除水池內(nèi)隱匿平臺(tái)，將大鼠從平臺(tái)所對(duì)象限放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間(即：目標(biāo)象限停留時(shí)間)。

1.3.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 跳臺(tái)儀實(shí)驗(yàn)箱為長約120 cm，寬12 cm，高30 cm的有機(jī)玻璃箱，共分為6室，每室長12 cm，寬12 cm，高30 cm。實(shí)驗(yàn)箱底面鋪有銅柵，銅柵通過電線與電源相連，電流控制在36 V。實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)銅柵上靠箱內(nèi)一角置絕緣臺(tái)(長徑5.7 cm，短徑4.5 cm，高4.8 cm的五邊形木塊)作為動(dòng)物回避電擊的安全區(qū)。試驗(yàn)裝置與計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄系統(tǒng)相連。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放入跳臺(tái)儀實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境5 min，之后將大鼠輕放于跳臺(tái)上，并將銅柵通電，當(dāng)大鼠從跳臺(tái)上跳下四肢接觸銅柵時(shí)會(huì)受到電擊，正常回避反應(yīng)是跳上跳臺(tái)返回安全區(qū)，逃避電擊，如此學(xué)習(xí)5 min，并記錄此5 min內(nèi)的觸電次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，以此為學(xué)習(xí)成績。24 h后進(jìn)行記憶能力測(cè)試，將大鼠置于跳臺(tái)上，記錄大鼠從停留在跳臺(tái)上至第1次跳下受電擊的時(shí)間即潛伏期和5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)(大鼠四肢同時(shí)接觸銅柵觸電的次數(shù))，以此作為記憶功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 在定位航行實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的總路程、以及逃避潛伏期與假手術(shù)組比較顯著延長，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明腦缺血誘導(dǎo)的癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，造模成功。與模型組比較，腦復(fù)明滴丸各劑量組以及安理申組逃避潛伏期明顯縮短，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與安理申組比較，腦復(fù)明各劑量組在逃避潛伏期方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在總時(shí)間方面，與模型組比較，腦復(fù)明滴丸各劑量組以及安理申組均能縮短找到平臺(tái)的時(shí)間，并有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。腦復(fù)明高、中劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。并且，與安理申組比較，腦復(fù)明高、中劑量組潛伏期縮短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，腦復(fù)明滴丸高、中劑量組以及安理申組目標(biāo)象限停留時(shí)間延長，并有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。腦復(fù)明高、中劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。與安理申組比較，腦復(fù)明各組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 腦復(fù)明滴丸對(duì)血管性癡呆大鼠Morris水迷宮的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.05。

表2 腦復(fù)明滴丸對(duì)大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 跳臺(tái)試驗(yàn) 在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠潛伏期明顯延長，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，腦復(fù)明滴丸各劑量組以及安理申組潛伏期明顯縮短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。腦復(fù)明各劑量組與安理申組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在錯(cuò)誤次數(shù)方面，各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 討論

血管性癡呆是由缺血、出血或急慢性腦缺氧等腦血管因素，導(dǎo)致腦組織損害，引起的腦組織血液循環(huán)障礙、腦功能減退的一種認(rèn)知功能缺損綜合征?；颊叨酁槁浴⑦M(jìn)行性、持續(xù)性智能障礙綜合征，臨床表現(xiàn)為記憶及認(rèn)知等功能障礙綜合征。血管性癡呆已成為繼阿爾茨海默病后的第二大癡呆疾病。隨著人口的老齡化，血管性癡呆發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。研究表明，VD是迄今為止唯一可防治的癡呆，如早期治療會(huì)具有可逆性[3]。因此探索VD發(fā)病的相關(guān)因素及發(fā)病機(jī)制，開發(fā)有效的治療藥物，是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

腦復(fù)明滴丸是基于中醫(yī)“解毒通絡(luò)”理論，由三七、梔子有效組分組成的現(xiàn)代化中藥。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，三七皂苷Rg1能通過降低腦組織AchE活性，降低腦組織中脂質(zhì)過氧化物、脂褐質(zhì)等的含量，改善記憶損傷模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能[4]。在大腦中動(dòng)脈栓塞導(dǎo)致的大鼠腦缺血，三七提取物能夠明顯改善大鼠的行為狀態(tài)，縮小腦缺血面積[5]。趙雪松等發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷能夠抑制ICAM-1和TNF-α的釋放，促進(jìn)腦出血后腦組織病理形態(tài)的恢復(fù)[6]。研究表明，梔子苷能改善慢性低灌注導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力受損，具有劑量依賴性，能明顯減輕VD大鼠皮層及海馬的病理變化，有一定的神經(jīng)保護(hù)以及防治癡呆作用[7]。梔子苷對(duì)缺血性腦神經(jīng)損傷中的自由基損傷具有很好的拮抗作用，對(duì)缺血性腦神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)作用[8]。梔子粗提物有改善擬癡呆模型鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用。本文采用的頸總動(dòng)脈結(jié)扎的方法制作大鼠血管性癡呆模型是一種公認(rèn)的研究癡呆的動(dòng)物模型[9]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩個(gè)部分。定位航行試驗(yàn)利用大鼠天性會(huì)水但又怕水的特點(diǎn)，迫使大鼠找到隱匿于水下的平臺(tái)上岸避水。通過數(shù)天反復(fù)訓(xùn)練，使大鼠形成條件反射，能夠運(yùn)用環(huán)境標(biāo)記判斷水下隱匿平臺(tái)的位置，從而形成穩(wěn)定的空間記憶。檢測(cè)指標(biāo)有逃避潛伏期、游泳總路程以及大鼠在逃避潛伏期內(nèi)的平均速度等。其中逃避潛伏期是通過記錄大鼠找到水下隱匿平臺(tái)時(shí)間的長短反映學(xué)習(xí)能力，是目前較為認(rèn)可的指標(biāo)。游泳總路程是大鼠捕捉到水下平臺(tái)經(jīng)過的軌跡，間接衡量其學(xué)習(xí)能力?？臻g探索試驗(yàn)是通過復(fù)合型學(xué)習(xí)，使大鼠形成空間參考記憶。空間探索試驗(yàn)是在定位航行試驗(yàn)后去除平臺(tái)，在平臺(tái)所對(duì)象限將大鼠放入水池中，記錄其在規(guī)定時(shí)間內(nèi)停留在原平臺(tái)所在象限的時(shí)間，以此來考察大鼠對(duì)原平臺(tái)位置的空間記憶能力。通過水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦復(fù)明滴丸可顯著縮短總路程與逃避潛伏期，說明腦復(fù)明滴丸對(duì)癡呆所致的學(xué)習(xí)障礙具有一定的改善作用。跳臺(tái)試驗(yàn)是反映動(dòng)物一次性被動(dòng)回避，反映記憶功能的試驗(yàn)。在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，腦復(fù)明滴丸能夠顯著縮短癡呆大鼠的潛伏期，可見治療后大鼠記憶能力已經(jīng)有所恢復(fù)。綜上所述，行為學(xué)的結(jié)果顯示，腦復(fù)明滴丸對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙有顯著的改善作用。在后續(xù)的研究中，我們將深入探討腦復(fù)明滴丸的藥效機(jī)制。

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(2014-05-26收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Naofuming Pill on of Learning and Memorizing Abilities of Rats with Vascular Dementia

Du Qinghong, Xu Ya, Li Weinghong, Di Bo, Li Yajie

(PreclinicalMedicalSchool,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To explore the effect of Naofuming pill (NFM) on abilities of learning and memorizing of rats with vascular dementia(VD). Methods: VD model of rats was induced by ligation of bilateral common carotid arteries. Aricept was as used positive control drug. Rats were randomly divided into sham operation group, model group, NFM high dose group, NFM middle dose group, NFM low dose group, as well as positive control group. The ability of learning and memorizing of rats were examined by Morris water maze test and step-down test. Results: In the Morris water maze test, NFM significantly shortened the total distance and the escape latency, and prolonged the residence time in the target quadrant. In the diving platform experiment, compared with model group rats, NFM significantly reduced latency. Conclusion: NFM can improve ability of learning and memoring in rats with VD.

Naofuming pill; Vascular dementia; Learning and memorizing

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)基礎(chǔ)理論重點(diǎn)學(xué)科及北京中醫(yī)藥大學(xué)氣化學(xué)說與藏象理論研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào):522/0100603001)

杜慶紅，博士，講師，主要研究方向?yàn)橹兴幱行ЫM分配伍的機(jī)制研究，E-mail:qhdu2005@126.com

徐雅，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藏象理論—心腦臟腑相關(guān)理論與實(shí)驗(yàn)研究，E-mail：xuya@bucm.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.019