西安交通大學第二附屬醫(yī)院(西安710004) 席 婕 劉 暉 許 珉

·臨床檢驗·

水通道蛋白1表達檢測在分泌性中耳炎診斷中的意義*

西安交通大學第二附屬醫(yī)院(西安710004) 席 婕△劉 暉△許 珉▲

目的：研究水通道蛋白1表達檢測在分泌性中耳炎診斷中的應用價值。方法：選取30份分泌性中耳炎組織標本為研究組,選擇同期行健康體檢的50份健康人體中耳組織標本為對照組,用免疫組織化學方法檢測所有標本中水通道蛋白1的表達。結(jié)果：①研究組咽鼓管及鼓室黏膜厚度分別為(147.94±8.38)μm、(30.71±4.64)μm,對照組咽鼓管及鼓室黏膜厚度分別為(30.70±3.58)μm、(20.55±4.40)μm，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②研究組鼓室黏膜、咽鼓管水通道蛋白1相對蛋白表達量分別為(145.58±13.65)、(140.05±12.45)，對照組鼓室黏膜、咽鼓管水通道蛋白1相對蛋白表達量分別為(195.84±24.80)、(208.40±21.58),兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：水通道蛋白1在分泌性中耳炎發(fā)生過程中起一定的作用,可作為分泌性中耳炎診斷的一項重要指標。

分泌性中耳炎主要是由咽鼓管功能障礙、局部感染及變態(tài)反應等引起,其典型特征為傳導性耳聾與鼓室積液[1],在兒童人群中比較常見,是導致兒童耳聾的一大危險因素[2]。相關研究表明水通道蛋白(AQP)在很多細胞質(zhì)膜中存在，一旦其發(fā)生異常,導致細胞內(nèi)信號異常且改變膜電位,引發(fā)水分積聚[3]。多項大鼠試驗表明水通道蛋白1參與到中耳積液形成及吸收的過程中,認為水通道蛋白1表達檢測可作為診斷分泌性中耳炎的重要指標之一[4]。本研究通過免疫組織化學法檢測分泌性中耳炎組織標本中的水通道蛋白1表達,與健康標本檢測結(jié)果進行比較,現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1 一般資料 選取兩院2011年1月至2013年12月采集的30份分泌性中耳炎組織標本為研究對象，其中男18例,女12例,年齡1～56歲，平均(30.3±1.2)歲，住院時間3～15d,平均(7.4±1.3)d。選擇同期行健康體檢的50例正常人群為對照組，其中男22例,女28例,年齡1～59歲，平均(30.2±1.4)歲。相關儀器：脫水機、石蠟切片機、電耳鏡、超速低溫離心機、圖像分析儀、恒溫水浴箱等。

2 方 法 在所有患者及健康兒童(由兒童及家長共同決定)同意下經(jīng)由耳鏡進行中耳鼓室及咽鼓管咽口組織部分采集(局部麻醉后刮片收集組織標本),患者或健康組織采集完成后馬上放入液氮中冷凍保存，以提取組織中的總蛋白及mRNA。①HE染色：部分組織經(jīng)由多聚甲醛(濃度為4%)固定及石蠟包埋→不間斷切片(厚度為5μm)→常規(guī)脫蠟至水→蘇木素染色5min→沖洗1min→鹽酸酒精(1%)分化1min→沖洗5s→沖洗10min→伊紅(95%)染色5s→分化10s→常規(guī)脫水封片→顯微鏡下觀察→測量咽鼓管黏膜與鼓室厚度。②SP法：烤箱中烤片(組織切片)20min→常規(guī)脫蠟至水,PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗15min,每隔5min1次→雙氧水孵育10min,PBS沖洗15min,每隔5min1次→高壓修復60s,PBS沖洗15min,每隔5min 1次→封閉20min,干燥后加兔抗人水通道蛋白1多克隆抗體(1︰200),將其保存在冰箱中(溫度為4℃)，一夜后行PBS沖洗，5min/次，共3次→免疫組化染色，蘇木素復染→顯微鏡觀察，常規(guī)脫水封片。光鏡下物質(zhì)為棕黃色，胞膜著色提示為陽性。

3 觀察指標 觀察并分析兩組標本中咽鼓管及鼓室黏膜水通道蛋白1相對蛋白表達量，另外用專業(yè)圖像分析儀測量兩組咽鼓管及鼓室黏膜厚度。

結(jié) 果

1 兩組咽鼓管及鼓室黏膜厚度測量結(jié)果比較 見表1。研究組咽鼓管及鼓室黏膜厚度高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 兩組咽鼓管及鼓室黏膜厚度測量結(jié)果比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05

2 兩組免疫組織化學染色結(jié)果比較 見表2。研究組鼓室黏膜、咽鼓管咽口黏膜水通道蛋白1相對蛋白表達量分別與對照組鼓室黏膜、咽鼓管咽口黏膜水通道蛋白1相對蛋白表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 兩組中耳相關部位水通道蛋白1蛋白表達 灰度值比較

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

1 分泌性中耳炎發(fā)病機制 目前臨床上分泌性中耳炎發(fā)病機制尚不明確,楊琳等學者認為多種因素造成中耳處于負壓狀態(tài),出現(xiàn)中耳黏膜水腫及滲液癥狀,從而引發(fā)中耳積液及分泌中耳炎[5]。而影響中耳壓力的因素包括咽鼓管功能(主要為通氣)、中耳黏膜功能(氣體交換)及其厚度、鼓膜彈性等。同時部分學者認為分泌性中耳炎的發(fā)生與中耳腔感染及炎癥密切相關。目前臨床上公認的是與中耳滲液形成、咽鼓管功能障礙有關,而水通道蛋白1在各組織毛細血管、成纖維細胞中廣泛存在,其異?？赡苡绊懙皆缙谥卸鷿B液形成。一般而言對正常人體性鹽水靜注,會造成氣道黏液增厚,出現(xiàn)水腫癥狀,但在水通道蛋白1功能無效患者中卻不是出現(xiàn)水腫現(xiàn)象,這表明水通道蛋白1表達對血管通透性起決定性作用。

2 水通道蛋白1表達檢測在分泌性中耳炎診斷中的應用價值 很多動物實驗模型研究表明水通道蛋白在各組織細胞膜(毛細血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞)中廣泛分布，該物質(zhì)直接參與毛細血管及其滋養(yǎng)細胞間的水運轉(zhuǎn)，若其出現(xiàn)異常，則會影響到細胞內(nèi)信號，造成水分聚集，引發(fā)中耳積液。水通道蛋白1作為第一個被發(fā)現(xiàn)的AQP亞型，經(jīng)免疫形態(tài)學及動物實驗模型研究后證明其主要分布在中耳血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞中，它除了與內(nèi)耳淋巴液平衡相關外，還在中耳腔微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起維持保護作用[6]。且研究還發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)病毒感染后其水通道蛋白1表達明顯下降，最終出現(xiàn)組織積液現(xiàn)象。

本研究就我院采集的30份分泌性中耳炎病理組織標本(研究組)與50份健康人群中耳組織標本(對照組)進行對照實驗,發(fā)現(xiàn)研究組標本組織中水通道蛋白1相對蛋白表達量(鼓室黏膜及咽鼓管咽口黏膜)明顯低于對照組(P<0.05)，可見水通道蛋白1在分泌性中耳炎發(fā)病中起一定的作用，可作為分泌性中耳炎診斷的重要指標之一。

[1] 趙海亮,周才杰,趙九洲,等.殺菌-通透性增強蛋白對分泌性中耳炎大鼠水通道蛋白和黏蛋白表達的影響[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科,2013,20(4)：200-203.

[2] 詹紅星,侯 薇,張 青,等.中耳炎性滲出液的產(chǎn)生及其病理影響[J].陜西醫(yī)學雜志,2012,41(2)：228-229.

[3] 馬玉強. AQP1、VEGF在變應性鼻炎大鼠鼻黏膜中的表達及其相關性研究[D].山西醫(yī)科大學,2012.

[4] 曾 麗.水通道蛋白4及黏蛋白5AC在哮喘小鼠支氣管肺組織的表達及意義[D].瀘州醫(yī)學院,2012.

[5] 楊 琳,趙守琴.分泌性中耳炎發(fā)病機制的研究進展[J].聽力學及言語疾病雜志,2014,23(3)：328-331.

[6] 崔昕燕.糖皮質(zhì)激素對分泌性中耳炎模型水通道蛋白1表達的調(diào)控[D].南京醫(yī)科大學,2011.

(收稿：2014-11-05)

Water channel protein 1 expression detection in the diagnosis of secretory otitis media

Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Xi Jie Liu Hui Xu Min

Objective: To study the expression of aquaporin 1 in detection of secretory otitis media with application value in the diagnosis of. Methods: select 30 copies of secretory otitis media organizations were research group, 50 cases underwent physical examination of health human middle ear specimens were used as control group. Immunohistochemical method was used to detect all the specimens of aquaporin 1 protein expression. Results: The study group of eustachian tube and tympanic mucosa thickness were (147.94 ± 8.38)μm and (30.71±4.64)μm, control group of eustachian tube and tympanic mucosa thickness were( 30.70±3.58)μm and (20.55±4.40)μm, there was significant difference between two groups (P<0.05). The study group tympanic mucosa, Eustachian tube relative protein expression were (145.58±13.65) and (140.05±12.45), the control group tympanic mucosa, Eustachian tube relative protein expression were (195.84±24.80) and (208.40±21.58), there was significant difference between two groups (P<0.05). Conclusion: Water channel protein 1 in secretory otitis media plays a certain role, can be used as an important index for diagnosis of secretory otitis media.

Otitis media with effusion/diagnosis Aquaporin 1/secretion

*陜西省科技研究發(fā)展計劃項目(2011K12-65)

伴滲出液中耳炎/診斷 水通道蛋白1/分泌

R764.21

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.041

△陜西省人民醫(yī)院耳鼻喉科

▲通訊作者