第四軍醫(yī)大學學員旅(西安710032) 白 威 楊薛康 楊國棟

·論著·基礎研究·

鈉氫交換蛋白1抑制劑對膿毒癥大鼠心臟損傷保護作用的實驗研究*

第四軍醫(yī)大學學員旅(西安710032) 白 威 楊薛康△楊國棟▲

目的：觀察鈉氫交換蛋白1(NHE1)抑制劑對膿毒癥大鼠心臟損傷的保護作用，并探討其可能的機制。方法：常規(guī)方法建立大鼠膿毒癥模型誘導心臟損傷。將SD大鼠隨機分為對照組、膿毒癥組和膿毒癥治療組,膿毒癥治療組大鼠注射鈉氫交換蛋白1抑制劑卡立泊來德,于傷后12h檢測左心室射血分數(shù)(LVEF)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6 (IL-6)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和丙二醛(MDA)水平。結果：膿毒癥組大鼠心臟損傷高于對照組,表現(xiàn)為LVEF值的降低和LDH、CK、CK-MB值的升高；膿毒癥治療組大鼠較膿毒癥組大鼠心臟損傷顯著減輕,表現(xiàn)為LVEF值的升高、LDH、CK和CK-MB值的降低。膿毒癥組大鼠TNF-α、IL-6、MPO、MDA水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義；SOD、CAT和GPx水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義；治療組大鼠上述指標顯著改善。結論：NHE1抑制顯著減輕膿毒癥誘導的心臟損傷，其部分機制可能是抑制了炎癥反應和氧化應激。

鈉氫交換蛋白(NHE)是一種跨膜蛋白,廣泛存在于所有真核細胞表面,其主要功能是將一個氫離子泵出細胞外，并獲得一個鈉離子，進而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的pH值[1-3]。NHE1是NHE家族中表達最為廣泛的亞型，在組織的缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著關鍵作用[2-4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，NHE1在燒傷后顯著活化，NHE1的抑制劑卡立泊來德可以減輕燒傷后的心臟損傷[5]。膿毒癥是燒傷后常見的嚴重并發(fā)癥，在本實驗中，我們建立大鼠膿毒癥模型，觀察NHE1在膿毒癥心臟損傷中的作用，并初步探討其可能的機制。

材料和方法

1 實驗材料 健康無特殊病原體級雄性SD大鼠70只,體質(zhì)量200±25g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，所有實驗操作經(jīng)第四軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會批準。試劑：卡立泊來德(cariporide)為德國Hoechst公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷、氯仿、甲醇、蔗糖、抗壞血酸、硫酸亞鐵和四氯化碳等實驗室常規(guī)試劑均為國產(chǎn)AR試劑。

2 方 法 ①動物分組及模型建立：大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，并根據(jù)隨機分組表法隨機分為對照組(10只)、膿毒癥組(30只)和膿毒癥治療組(30只)。以戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉,行腹正中切口,采用盲腸結扎穿孔術(CLP)復制膿毒癥大鼠模型。對照組除不作環(huán)形結扎和針刺穿孔外，其余操作均與膿毒癥組相同。膿毒癥治療組大鼠腹腔注射卡立泊來德(0.4mg/kg)1 ml；本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。②檢測指標與方法：大鼠于傷后12h斷頭處死,另處死對照組大鼠。大鼠斷頭后立即取血,1000 r/min離心5min,分離血漿,-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫笮募〗M織,加入9倍體積的等滲鹽水制成勻漿,離心后取上清，-80℃保存檢測以下指標。心臟功能指標：左心室射血分數(shù)(LVEF)使用超聲心動圖檢測。心肌損傷指標：包括血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB),應用全自動生化分析儀(日本Olympus公司產(chǎn)品)檢測。炎性指標：包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6 (IL-6)和髓過氧化物酶(MPO),腫瘤壞死因子α(TNF-α)采用ELISA法檢測,按上海森雄科技公司ELASA試劑盒說明書進行。氧化應激指標：包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)含量,使用南京建成科技公司試劑盒檢測。

結 果

1 NHE1抑制對膿毒癥心臟損傷的影響 與對照組相比，膿毒癥組大鼠LVEF值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；治療組大鼠LVEF值顯著高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；另外，與對照組相比，膿毒癥組大鼠血清LDH、CK及CK-MB值顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，治療組大鼠上述指標較膿毒癥組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。

表1 3組大鼠LVEF、LDH、CK及CK-MB值變化

2 NHE1抑制對膿毒癥后炎性因子表達的影響 與對照組相比，膿毒癥組大鼠血清TNF-α、IL-6及MPO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；治療組大鼠上述指標較膿毒癥組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。膿毒癥組大鼠心肌組織TNF-α、IL-6及MPO水平較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；治療組大鼠上述指標均低于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

3 NHE1抑制對膿毒癥后氧化損傷指標的影響 與對照組相比,膿毒癥組大鼠血清SOD、CAT、GPx活性顯著降低,MDA含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；治療組大鼠血清SOD、CAT、GPx活性較膿毒癥組明顯升高,MDA含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。膿毒癥組大鼠心肌組織SOD、CAT、GPx活性低于對照組,MDA含量高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而治療組大鼠心肌組織SOD、CAT、GPx活性顯著高于膿毒癥組,MDA含量低于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表4、5。

表2 3組大鼠血清TNF-α、IL-6及MPO水平變化

表3 3組大鼠心肌組織TNF-α、IL-6及MPO水平變化

討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)NHE1抑制劑卡立泊來德顯著減輕了膿毒癥后的心臟損傷，表現(xiàn)為心功能的改善和心肌酶的降低，進一步證實了NHE1抑制對膿毒癥后心臟損傷的保護作用，并對其機制進行了初步探討。

雖然膿毒癥后心臟損傷的機制尚不完全清楚，但越來越多的證據(jù)表明炎癥反應和氧化應激均發(fā)揮著關鍵的作用[5-9]。近年的研究顯示，NHE1可以調(diào)節(jié)炎癥進程，NHE1活化可以促進中性粒細胞募集，并且誘導巨噬細胞活化。體內(nèi)外實驗均發(fā)現(xiàn)，NHE1的抑制劑可以顯著抑制炎性因子的產(chǎn)生[10-11]。在本實驗中，NHE1抑制顯著減輕了心肌組織炎癥反應和全身炎癥反應。這說明NHE1抑制對膿毒癥后心臟損傷的保護作用可能與其抗炎機制有關。

表4 3組大鼠血清SOD、CAT、GPx及MDA含量變化

表5 3組大鼠心肌組織SOD、CAT、GPx及MDA含量變化

最新的研究還發(fā)現(xiàn)，NHE1在線粒體氧化應激過程中發(fā)揮著關鍵的作用，NHE1的抑制可以顯著減輕活性氧的生成[12-14]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)卡立泊來德減輕了膿毒癥導致的氧化損傷，提高了抗氧化酶的含量，說明NHE1抑制顯著減輕了膿毒癥后的氧化應激，提示NHE1抑制對膿毒癥后心臟損傷的保護作用也可能是對氧化應激的抑制所致。

NHE1參與臟器損傷的機制是復雜的。在缺血再灌注損傷過程中，NHE1的活化導致細胞內(nèi)鈉離子升高，進而活化鈉鈣泵，導致細胞內(nèi)鈣離子增加，進而引起鈣離子介導的細胞凋亡和組織損傷[3-4]。而鈣離子介導的細胞凋亡和組織損傷在膿毒癥后的心肌損傷中同樣發(fā)揮著重要作用[15]。本實驗僅明確了NHE1在膿毒癥后心臟損傷中的作用，探討了其部分機制，進一步的研究還在繼續(xù)。

綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)NHE1的抑制顯著減輕了膿毒癥誘導的心臟損傷，其部分機制可能是通過抑制了炎癥反應和氧化應激。

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(收稿：2015-04-20)

Study was designed to investigate the cardioprotective role of Na+/H+exchanger 1 (NHE1) inhibition after sepsis of rats

Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Bai Wei Yang Xuekang Yang Guodong

Objective: This study was designed to investigate the cardioprotective role of Na+/H+exchanger 1 (NHE1) inhibition after sepsis, and explore the potential mechanisms.Methods: A common sepsis model was used to induce cardiac injury in rats. All rats were randomly divided into 3 groups：the control group, the sepsis group and the treatment group. Changes in left ventricular ejection fraction (LVEF), the lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), MB isoenzyme of creatine kinase (CK-MB), tumor necrosis factor (TNF-α),interleukin (IL-6),myeloperoxidase (MPO) activity, superoxidase dismutase (SOD), catalase (CAT),glutathione peroxidase (GPx) and malondialdehyde (MDA) were examined.Results: Sepsis resulted in significant cardiac injury, as manifested by lowered LVEF, increased serum LDH, CK and CK-MB, compared with the control group. NHE1 inhibition markedly alleviated cardiac injury. In addition, sepsis caused increased level of TNF-α、IL-6、MPO and MDA, and decreased of SOD、CAT and GPx, which were improved by NHE1 inhibition in treatment group.Conclusion: NHE1 inhibition alleviates sepsis-induced cardiac injury, possibly by inhibiting sepsis-induced oxidative stress and inflammation response.

Sepsis Heart injuries @Na+/H+exchanger 1

*國家自然科學基金資助項目(81201463)

膿毒癥 心臟損傷 @鈉氫交換蛋白1

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.001

△第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科

▲通訊作者：第四軍醫(yī)大學基礎部生物化學與分子生物學教研室