劉皓，羅杰，劉楚吾

（廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025）

研究動物胚胎發(fā)生可以認識和掌握發(fā)生的規(guī)律、熟悉發(fā)生的現(xiàn)象，為生產(chǎn)實踐服務(wù)。在水產(chǎn)業(yè)中，提高魚、蝦、貝等的受精率及幼苗的成活率，進行種質(zhì)保存和良種培育等方面都離不開對胚胎發(fā)育的研究。

紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus），隸屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形目、笛鯛科、笛鯛屬（成慶泰 等，1987），俗稱紅魚、紅槽魚、紅雞、紅笛鯛。為暖水性近底層魚類，我國主要產(chǎn)于南海和東海南部，為南海重要經(jīng)濟魚類之一。紅鰭笛鯛個體較大，肉質(zhì)豐厚堅實，生長速度快，產(chǎn)量高，經(jīng)濟效益顯著。近年來，對紅鰭笛鯛的研究有不少報道，但主要集中在生化研究、遺傳學(xué)、繁殖技術(shù)及養(yǎng)殖技術(shù)等方面的研究（楊春玲 等，2010；鄭樂云 等，2004；陳武各，2002；彭銀輝 等，2008），其胚胎發(fā)育的研究只見個別文獻中有零散的報道（佘忠明 等，2005）。本文擬對紅鰭笛鯛早期胚胎發(fā)生的形態(tài)學(xué)進行研究，了解早期胚胎發(fā)育的形態(tài)發(fā)生過程和特點以及在正常自然溫度下各發(fā)育階段所經(jīng)歷的時間，旨在為其人工繁殖和育苗起到一定的指導(dǎo)作用，以期進一步利用和保護好這一優(yōu)良種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 材料

供胚胎發(fā)育觀察的紅鰭笛鯛魚受精卵于2011年6月和2012年8月分別由海南省三亞市紅沙龍勝魚苗場和海南省三亞市蜈支洲島后海村海水養(yǎng)殖基地提供。

1.2 方法

紅鰭笛鯛親魚產(chǎn)卵后，用手抄網(wǎng)采集紅鰭笛鯛的受精卵置于25 L 塑料桶中，在水溫28 ℃、鹽度32.2 的干凈海水中充氣孵化，并定期換水。每次取10 個左右胚胎，連續(xù)采樣，在Olympus SZ 雙筒體視顯微鏡下采用載玻片（凹玻片） 直接觀察法連續(xù)觀察活體胚胎的發(fā)育過程，并參考其他魚（王彥懷等，2007） 胚胎發(fā)育的分期方法記錄各期發(fā)育的時間和主要形態(tài)學(xué)特征，拍照。同時取樣固定胚胎發(fā)育各時期的部分材料于70%酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

胚胎發(fā)育時期經(jīng)歷時間為視野中有50%的胚胎從前一期胚胎到下一期所經(jīng)歷的時間。

2 結(jié)果

紅鰭笛鯛早期胚胎的形態(tài)發(fā)生過程可分為受精卵、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成等6個階段，24 個時期。從受精到孵化出膜經(jīng)歷了約20 h 后，然后進入胚后發(fā)育階段。

2.1 紅鰭笛鯛早期正常胚胎發(fā)育各階段的形態(tài)特征

受精卵期：紅鰭笛鯛受精卵為圓球形，平均直徑為500 μm 左右，浮性端黃卵，透明，內(nèi)有一大油球。

胚盤形成期：受精后15 min 原生質(zhì)聚集于動物極，隆起形成胚盤（圖版1 ∶1）。

2 細胞期：受精后30 min 進行第1 次卵裂，為盤狀卵裂，經(jīng)裂，將胚盤均分為兩個細胞（圖版1 ∶2）。

4 細胞期：受精后42 min 進行第2 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，分裂面與第一次卵裂面垂直，胚盤由2 個細胞分裂為4 個細胞（圖版1 ∶3）。

8 細胞期：受精后57 min 進行第3 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，具兩條分裂溝（2 個分裂面），分別在第1 次卵裂溝的兩側(cè)、與第1 次卵裂面平行而與第2 次卵裂面垂直，胚盤由4 個細胞分裂為8 細胞，規(guī)則地排列成2 行（圖版1 ∶4）。

16 細胞期：受精后1 h 13 min 進行第4 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，具兩條分裂溝（兩個分裂面），分別在第2 次卵裂溝的兩側(cè)、與第2 次卵裂面平行而與第1、3 次卵裂面垂直，胚盤由8 個細胞分裂為16 個細胞，規(guī)則地排列成4 行，每行4個細胞（圖版1 ∶5）。

32 細胞期：受精后1 h 36 min 進行第5 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，具4 條分裂溝（4 個分裂面），分別在第1、3 次卵裂面平行而與第2、4 次卵裂面垂直，胚盤由16 個細胞分裂為32 個細胞，細胞排列已不那么規(guī)則。

64 細胞期：受精后2 h 進行第6 次卵裂，盤狀卵裂，胚盤由32 個細胞分裂為64 個細胞，排列不規(guī)則，大小不均等，胚盤細胞層數(shù)增加，顯微鏡下側(cè)面觀，可見到細胞明顯重疊現(xiàn)象，顯然已經(jīng)出現(xiàn)緯裂。

由于是盤狀卵裂，分裂只在胚盤的區(qū)域進行縱向分裂（經(jīng)裂），因此從第1 次至第5 次分裂形成了一單層分裂球，而分裂球都沒有完整的細胞膜，即分裂球與卵黃之間沒有細胞膜的隔離，所形成的胚層似乎是一個合胞體細胞層。

多細胞期：受精后2 h 33 min 胚層細胞繼續(xù)分裂，并且出現(xiàn)了橫向分裂（緯裂）。由于細胞不斷分裂，細胞數(shù)量不斷增加，但體積越來越小，細胞排列變得不規(guī)則，細胞之間由界限清楚，慢慢變得不清楚，從而形成了桑葚狀的多細胞胚胎（圖版1 ∶6）。

高囊胚期：細胞分裂繼續(xù)進行，數(shù)量不斷增多，細胞體積越分越小，胚胎細胞層次逐漸增多，胚盤位于卵黃上慢慢升高，受精后3 h，胚胎進入高囊胚期。此時胚盤突起呈高帽狀，表面凹凸不平，邊緣較直，細胞層次較厚（圖版1 ∶7）。

低囊胚期：隨胚胎的繼續(xù)發(fā)育，受精后5 h 42 min，囊胚細胞覆蓋在卵黃上逐漸向周圍擴展，因此，囊胚形狀變低，囊胚層變薄，并且出現(xiàn)了囊胚腔而成為低囊胚期。低囊胚期胚胎表面較光滑，胚盤邊緣與卵黃表面接觸，在接觸處可見到卵黃多核體，由卵黃多核體牽引，胚層逐漸向下伸展（圖版1 ∶8）。

原腸早期：囊胚層細胞繼續(xù)分裂，并且沿卵黃的表面逐漸向植物極擴展、下包，由于囊胚層細胞分裂的速度快于向植物極擴展、下包的速度，部分囊胚層邊緣細胞向內(nèi)卷入而形成胚環(huán)，受精后6 h 27 min，囊胚層細胞下包整個卵黃囊的1/2 即為原腸早期（圖版1 ∶9）。之后進入原腸中期。

原腸中期：囊胚層細胞繼續(xù)下包，受精后7 h 22 min，胚層細胞下包整個卵黃囊的2/3 即進入原腸中期（圖版1 ∶10）。此時胚環(huán)加寬，增厚，胚環(huán)處細胞向胚唇集中突出形成盾狀突起為胚盾。

原腸晚期：囊胚層細胞繼續(xù)下包，受精后8 h 39 min，胚層下包卵黃3/4～4/5 時，即發(fā)育至原腸晚期（圖版1 ∶11）。此時環(huán)形的胚孔出現(xiàn)，環(huán)形胚孔中露出部分卵黃稱為卵黃栓。胚盾逐漸向前伸展，擴大成舌狀。

胚孔封閉期：受精后9 h 36 min，原腸晚期胚層細胞繼續(xù)下包，直至胚層細胞將卵黃完全包裹，胚孔封閉而發(fā)育到胚孔封閉期。原腸形成后，器官開始形成，胚盤背面增厚，形成神經(jīng)板。神經(jīng)板中央線下內(nèi)有一條圓柱狀脊索；接著，較寬厚的神經(jīng)板前部膨大形成腦泡，腦泡繼而分為前腦泡、中腦泡和后腦泡；而神經(jīng)板的后端窄而薄，此時胚體中軸器官基本形成，已可區(qū)分頭、尾（圖版1 ∶12）。

克氏泡期：受精后12 h 09 min 胚體越來越明顯，胚體末尾接近卵黃部位出現(xiàn)克氏泡（圖版1 ∶13）。

視囊期：腦泡分化后，前腦部兩側(cè)出現(xiàn)1 對視囊（圖版1 ∶14），隨后，視囊凹陷成視杯。

聽板期：腦泡的背后方與體節(jié)前方之間的左右兩側(cè)，各形成一聽板，聽板凹陷成聽囊（圖版1 ∶15）。身體出現(xiàn)色素細胞。

晶體形成期：受精后12 h 32 min，在視囊的誘導(dǎo)下，其外的外胚層形成晶狀體（圖版1 ∶16），尾部逐漸凸起。

尾芽期：受精后15 h 32 min 胚體尾部少部分與卵黃囊分離，發(fā)育成尖錐狀尾芽（圖版1 ∶17） .

肌肉效應(yīng)期：受精后16 h 26 min，胚體尾部開始扭動（圖版1 ∶18）。

心跳期：心臟位于胚體頭下后方，受精后17 h 31 min 心臟開始搏動（圖版1 ∶19），起初搏動很微弱，逐漸變得快而有力，心跳頻率約85 次/min。

孵化前期：胚體繼續(xù)發(fā)育，受精后18 h 55 min胚體扭動較前一階段頻繁而劇烈，尾部可左右抽動、卷曲（圖版1 ∶20）。這樣的運動有利于卵膜破裂，即將孵化出膜。

脫膜孵化期：受精后約20h，仔魚大量出膜(圖版1∶21)。由胚胎頭部兩眼周圍的表皮細胞分化形成的單細胞腺分泌孵化酶，使卵膜變薄、溶解，同時由于胚體的不斷扭曲、擺動，使胚胎從卵膜中孵化出來。

2.2 紅鰭笛鯛早期正常胚胎發(fā)育發(fā)育時程表

表1 紅鰭笛鯛胚胎發(fā)育時程表（水溫：28 ℃鹽度：32.2）

3 討論

3.1 關(guān)于硬骨魚類早期胚胎發(fā)育的分期

硬骨魚類早期胚胎發(fā)育是指從受精卵到孵化出膜，一般分為受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官發(fā)生期等6 個階段，進而可細分為30 個左右時期（曲漱惠 等，1980）。由于沒有統(tǒng)一的劃分標準，也可能因為種類差異，分期方法不盡一致，不管是大階段的劃分還是時期的劃分都有增、刪和合并的現(xiàn)象。如劉筠（1993） 將草魚劃分為28 個時期，多了一個多細胞期，將神經(jīng)胚分成了早、中、晚期，少了眼基出現(xiàn)期、尾鰭出現(xiàn)期、晶體出現(xiàn)期、嗅窩期、耳石期；陳福艷等（2011） 將丁鱥魚分為30 個時期少了眼基出現(xiàn)期；鄒記興等（2003） 將點帶石斑魚分為26 個期；張海發(fā)等（2008） 將鞍帶石斑魚、王興春（2014） 將斑鱾以及陳樸賢（2012）將犬齒牙鲆分為27 個時期，等等。本文根據(jù)紅鰭笛鯛胚胎形態(tài)發(fā)生的特點，參考前述及其他學(xué)者（陳國華 等，2001；杜偉 等，2004；夏連軍 等，2005；張玉明 等，2010；于道德 等，2014；王永明 等，2014；張海發(fā) 等，2006） 對其他魚的研究結(jié)果，將其早期胚胎的形態(tài)發(fā)生過程同樣分為受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成等6 個階段，再細分為受精卵、胚盤隆起（1-細胞期）、2-細胞期、4-細胞期、8-細胞期、16-細胞期、32-細胞期、64-細胞期、多細胞期、高囊胚期、低囊胚期、早原腸胚期、中原腸胚期、晚原腸胚期、胚孔封閉期、克氏泡期、視囊期、聽板期、晶體形成期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、出膜前期、出膜（孵化期） 24 個時期。紅鰭笛鯛在水溫28 ℃、海水鹽度32.2 的條件下從受精到孵化出膜經(jīng)歷了約20 h。其形態(tài)發(fā)生過程與點帶石斑（Epinephelus malabaricus）、黃鯛（Dentex tumifrons）、金頭鯛（Sparus aurata），等其他海水魚的發(fā)育過程相似。

（圖1待續(xù)）

圖1 紅鰭笛鯛早期胚胎發(fā)育過程

3.2 關(guān)于硬骨魚胚胎發(fā)育的時序

胚胎發(fā)育是一個連續(xù)的過程，上一個階段還沒有全部完成，下一階段就開始了，即前一個組織結(jié)構(gòu)還未完全形成，下一個組織結(jié)構(gòu)的發(fā)生便啟動了，一個接著一個，互相重疊甚至是同時發(fā)生，特別是器官發(fā)生時更是如此，所以分期或者發(fā)育階段的劃分是人為的。胚胎發(fā)育時期或階段雖然是人為劃分的，但每一個階段都有其主要結(jié)構(gòu)特點。而且每一物種的正常發(fā)育都是按其本身具有的規(guī)律進行。按照一般正常發(fā)生規(guī)律，在脊椎動物原腸胚形成過程中外胚層已經(jīng)分化為神經(jīng)外胚層和表皮外胚層，神經(jīng)外胚層通過神經(jīng)胚形成而形成神經(jīng)管，神經(jīng)管將分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（曲漱惠 等，1980；Gilbert，2010；尤永隆 等，2011）。神經(jīng)管形成后（在高等脊椎動物胚胎后端的神經(jīng)管尚未完全形成），首先其本身前端分化出前、中、后（菱） 腦泡，然后，前腦泡的兩側(cè)（間腦位置） 向左右各凸出一個視泡。本文對紅鰭笛鯛胚胎發(fā)育的研究認為原腸形成后的胚孔封閉期和克氏泡期便是神經(jīng)胚期，在這期間神經(jīng)管形成，胚體中軸器官基本形成，已可區(qū)分頭、尾（圖版1 ∶12-13）。神經(jīng)管前部膨大形成腦泡，緊接著，視泡、聽板等器官形成。這一結(jié)果與一般發(fā)育過程及大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致（王彥懷 等，2007；陳國華 等，2001；鄒記興 等，2003；謝菁 等，2009；陳樸賢，2012；王永明 等，2014；?？姑?等，2005；李明德，1987；Evans，1961；Kimura et al，1989），而與斜帶石斑魚腦泡的形成在聽囊形成后的結(jié)果不一致（張海發(fā) 等，2006）。當然，在不同種的魚，某一個器官、組織的出現(xiàn)的具體時間可能有一定的差異，同時，外部形態(tài)觀察結(jié)果一定要通過切片、解剖觀察來證實才更準確。

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