黃培池

甲磺酸帕珠沙星(Pazufloxacin Mesilate)是第三代氟喹諾酮類抗生素。甲磺酸帕珠沙星是一種廣譜抗菌藥物，在體內外均表現出很強的抗菌活性，目前，廣泛適用于革蘭陽性菌及革蘭陰性菌的感染。本實驗通過測定甲磺酸帕珠沙星對臨床常見致病菌的最低抑菌濃度，觀察其抗菌活性，進而研究對大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的抗生素后效應，為臨床合理用藥，設計最佳給藥方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 甲磺酸帕珠沙星:含量99.5%，效價76.84%，批號20140310(江蘇豪森制藥集團提供);左氧氟沙星(對照藥物):含量97.2%，樣品號130455 –200202，中國藥品生物制品檢定所提供;水解酪蛋白(MH)瓊脂(批號20131112)，營養(yǎng)肉湯(批號20131008)，均由杭州天和微生物試劑有限公司生產;1% 氯化三苯四氮唑(TTC):(批號821218，北京化工廠生產)。

1.1.2 菌株 205 株臨床致病菌由徐州市第四人民醫(yī)院呼吸科和泌尿科自患者尿液或痰中分離培養(yǎng)所得，其中包括肺炎克雷伯菌27 株、其他克雷伯菌2 株、腸桿菌屬6 株、表皮葡萄球菌10 株、葡萄球菌屬10 株、糞腸球菌5 株、銅綠假單胞菌11 株、其他假單胞菌3 株、陰溝腸桿菌13 株、不動桿菌屬13株、枸櫞酸桿菌2 株、鏈球菌屬6 株、流感嗜血桿菌14 株。三株標準菌大腸埃希氏菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、銅綠假單胞菌ATCC 27853 均由中國藥品生物制品檢定所提供;測定PAE 所用的大腸埃希氏菌由徐州市第四人民醫(yī)院泌尿科自患者尿液中分離培養(yǎng)所得，肺炎克雷伯氏菌由徐州市中醫(yī)院呼吸科自患者痰中分離培養(yǎng)所得。

1.1.3 儀器 MIT – P 型多點接種儀;TN－100B 型托盤式扭力天平;LS– B35L 型立式壓力蒸汽滅菌器;微量進樣器;GNP–9160 型隔水恒溫培養(yǎng)箱;PW/10 –002 型臺式保溫培養(yǎng)箱;XW–80A 型旋渦混合器;MA110 型電子分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用瓊脂稀釋法。

1.2.1.1 瓊脂平板的制備 用托盤式扭力天平稱取瓊脂30.4 g，按38 g/1000 ml 的比例，在三角瓶中用800 ml 純化水配成瓊脂溶液，將其置于壓力蒸汽滅菌器中120℃滅菌20 min后，取出備用，在無菌條件下，將其倒入平皿中，每皿20 ml。其中，血瓊脂平板按特定方法制備。待瓊脂凝固后，翻轉，備用。

1.2.1.2 增菌 將瓊脂平板按放射狀平均分成8 份，按細菌增菌清單標記平板，使用接種環(huán)將測試菌接種在對應區(qū)域中，每皿接種8 株不同菌落。其中，流血嗜血桿菌和鏈球菌要接種在血瓊脂平板上。接種完畢后，將其倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，備用。

1.2.1.3 抗菌藥液的制備 在無菌條件下，精密配制濃度為5 120 μg/ml 的抗菌藥液，將其依次進行二倍稀釋，分別得到2 560 μg/ml、1 280 μg/ml、640 μg/ml、320 μg/ml、160 μg/ml、80 μg/ml、40 μg/ml、20 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、2.5 μg/ml、

1.25 μg/ml、0.6 μg/ml、0.3 μg/ml、0.16 μg/ml 系列濃度的抗菌藥液。

1.2.1.4 含藥瓊脂平板的制備 在已經作好標記的滅菌培養(yǎng)皿中加入對應濃度的抗菌藥液1 ml，再取經121℃20 min 滅菌的MH 瓊脂溶液19 ml，加入到每個培養(yǎng)皿內，邊加邊搖晃培養(yǎng)皿，使藥物和培養(yǎng)基充分混勻，即得含藥瓊脂平板，此時藥物濃度分別為256 μg/ml、128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml、0.125 μg/ml、0.06 μg/ml、0.03 μg/ml、0.016 μg/ml、0.008 μg/ml。以上操作均在無菌條件下進行。

1.2.1.5 接種和判讀 按細菌接種清單排列接種細菌的順序，并將含有藥液的培養(yǎng)皿按組擺放整齊。取滅菌好的小玻璃試管27 只按照細菌的接種清單對其進行標號，置于試管架上。每只試管中加入滅菌生理鹽水1 ml，用接種環(huán)挑取細菌少許，置于1 ml 的滅菌生理鹽水中，振蕩，使其分散均勻，用0.5 麥氏比濁管校正濁度，使菌液濃度為108 cfu/ml。然后，連接電源(變壓器電源為100V)，安裝接種棒。將盛有校正好濁度的菌液試管，按照順序放入接種盤中，將接種好的培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h 后，判讀結果，以無菌落生長的最低藥液濃度為該藥對待測菌的最低抑菌濃度。

1.2.1.6 質量控制 分別選用大腸埃希氏菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、銅綠假單胞菌ATCC 27853 標準菌株，在同一實驗條件下測定MIC，對整個實驗過程進行質量控制。

1.2.2 抗生素后效應(PAE)的測定

1.2.2.1 抗菌藥物溶液的制備 在無菌條件下，將精密稱取的甲磺酸帕珠沙星10.7 mg，溶解到10 ml 滅菌生理鹽水中，配制成16 MIC×6400 倍的抗菌藥物溶液后(待測菌的MIC 值為0.008 ug/ml)，再分別用滅菌生理鹽水稀釋成16 MIC、8 MIC 和4 MIC 的抗菌藥物溶液，備用。

1.2.2.2 PAE 的測定 挑取4～6 個待測菌的單一菌落，接種于10 ml 營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)箱中孵育8～12 h 后，取該菌液2 ml 加入到18 ml 營養(yǎng)肉湯中，用0.5 麥氏比濁管校正濁度，使菌液濃度為108 cfu/ml。再將其進行50 倍稀釋后，分別取1 ml 該菌液加入到已編號為T、C1、C2、C3 的4 支試管中，在實驗管T 中加入1 ml 16 MIC 的抗菌藥液，對照管C1 和對照管C2 中分別加入1 ml 滅菌生理鹽水，對照管C3 中加入1 ml 16 MIC 的抗菌藥液(作為抗菌藥持續(xù)作用對照)，使4 支試管中菌液濃度均為106 cfu/ml，T 和C3 藥液濃度為8 MIC。將4 支試管置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h 后，用營養(yǎng)肉湯分別對T、C1、C2 管中的培養(yǎng)液進行1000 倍稀釋祛除藥物，并在C2 管中加入抗菌藥物，其濃度為T 管中被稀釋后的藥物濃度，作為殘余藥物造成后效應的證明對照，確定此時為測定PAE 的零點，然后置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，在孵育的0、1、2、3、4、5、6、7 h，分別吸取各管中培養(yǎng)液進行一定倍數稀釋，然后吸取稀釋液25 μl，均勻涂布于含有TTC 的瓊脂平板上，倒置于37℃培養(yǎng)箱中孵育18 h 后，進行菌落計數。該實驗過程重復3 次取其平均值，根據稀釋度計算cfu/ml，以孵育時間為橫坐標，以活菌數cfu/ml 的對數為縱坐標，應用計算機Microsoft Excel 2000 軟件繪制細菌生長曲線。以同法測定藥物濃度為4 MIC、2 MIC 時甲磺酸帕珠沙星對大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的PAE。

1.2.2.3 PAE 的計算 PAE 為與藥物作用過的細菌和未與藥物作用過的細菌各自活菌數增加一個對數單位所需的時間差，即以培養(yǎng)液被稀釋后T 管中細菌增殖一個對數單位所需的時間減去C1 管中細菌增殖一個對數單位所需的時間。

PAE(h)=T－C1

T 和C1分別為實驗管和對照管1 中細菌各自增加一個對數值(10 倍)所需的時間，通過細菌生長動力學曲線求出。

2 結果

2.1 甲磺酸帕珠沙星和左氧氟沙星對MICI 測定結果 見表1、表2。

2.2 不同濃度甲磺酸帕珠沙星對大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的PAE 值 見表3。

表1 甲磺酸帕珠沙星MIC 測定值結果分析(μg/ml)

表2 左氧氟沙星MIC 測定值結果分析(μg/ml)

表3 大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的PAE 值(h)

3 討論

甲磺酸帕珠沙星是一種抗菌譜廣，抗菌作用強，對多數革蘭陽性菌及革蘭陰性菌有較好抗菌作用的氟喹諾酮類藥物，本實驗結果也表明，甲磺酸帕珠沙星對各種不同臨床常見致病菌的抗菌活性均較強，尤其對肺炎克雷伯氏菌，其MIC50 和MIC90 分別為≤0.008 μg/ml、0.016 μg/ml;另外，陰溝腸桿菌對甲磺酸帕珠沙星也比較敏感。

本實驗研究結果也表明，甲磺酸帕珠沙星對大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌均存在明顯的PAE，且隨著藥物濃度的增大，PAE 值隨之增大。大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌對甲磺酸帕珠沙星存在濃度依賴性，且藥物對大腸埃希氏菌的PAE 明顯長于肺炎克雷伯氏菌，盡管甲磺酸帕珠沙星對大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的MIC 相同，所以，在臨床使用甲磺酸帕珠沙星時，對大腸埃希氏菌引起的感染，用藥間隔要長于肺炎克雷伯氏菌引起的感染。

近年來，在國內外抗感染藥物研究領域開始受到關注的新理論，是抗菌藥物對細菌特有的效應，對PAE 的研究可提供抗菌藥效動力學指標，同時更新傳統(tǒng)的要求血藥濃度持續(xù)高于有效濃度給藥方案的設計思想。由于PAE 反映了抗菌藥清除后或濃度大大低于MIC 時細菌仍受到抑制，因此對有明顯PAE 且毒性較低的藥物，在不影響療效的同時，可減少用藥次數和提高單次給藥量，這樣不僅方便用藥，而且還可降低藥物的不良反應和費用，保持或提高療效。

［1］楊信怡，游雪甫.注射用帕珠沙星的藥理研究和臨床應用［J］.國外醫(yī)藥·抗生素分冊，2003，24(2):80-87.

［2］王 睿，方 翼，杜麗華，等.4 種頭孢菌素的抗生素后效應影響因素［J］.中國臨床藥學雜志，1998，7(2):77-79.

［3］王 睿，薛俊峰，方 翼，等.格帕沙星與氧氟沙星體外抗生素后效應研究［J］.2005，30(2):111-113.