黃培池，王 娟

環(huán)孢素是1972年從多孢子木霉菌中提取的一種強效、高選擇性免疫性制劑，目前廣泛用于器官移植手術后抗排斥反應和多種疾病的輔助治療［1］。近年來隨著眼角膜移植手術的發(fā)展，同樣用于抑制角膜移植術后的免疫排斥反應，口服、注射給藥雖也可有效地治療多種與免疫有關的眼科疾病，但常引起嚴重的不良反應，如肝、腎損害等。眼部用藥可在角膜中保持較高藥物濃度，同時血藥濃度比較低［2］，可在提高療效的基礎上，降低其毒副作用，減少全身用藥的不良反應和高額費用。環(huán)孢素還可通過減少T 淋巴細胞浸潤、下調炎癥因子以及抑制淚腺和結膜上皮細胞的凋亡而治療干眼癥［3］。環(huán)孢素具有脂溶性，在水中幾乎不溶，有報道采用魚肝油作為溶劑使用的［4］。而本制劑選用滅菌的蓖麻油作為溶劑，使環(huán)孢素滴眼液具有較好的粘性，延長了藥物在眼表面的作用時間，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器:惠普1100 高效液相色譜儀;C18 柱(250 mm×4.6 mm，10 μm;2UV－TU－1221 可見紫外分光光度計(北京通用儀器設備廠);電子分析天平(Sartorius Basic BA－110S);AS2060B－ 超聲儀(AUTOSCIENGE)。試劑:環(huán)孢素(福建抗生素集團有限公司批號:141101);環(huán)孢素對照品(中國藥品生物制品檢定所100mg 批號:130625 含量:98.8%);藥用蓖麻油(湖南爾康制藥有限公司，批號:20120604);甲醇(色譜純、分析純);無水乙醇(分析純)。

1.2 制備工藝 處方:環(huán)孢素1 g，氫化蓖麻油加至100 ml。制備方法:在無菌條件下，稱取環(huán)孢素1 g，加入100 ml 刻度燒瓶中，加入經滅菌后的蓖麻油約90 ml，置60℃恒溫水浴中，攪拌至全溶解后，加氫化蓖麻油至全量，攪勻，分裝即得［3］。

1.3 含量測定

1.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取環(huán)孢素對照品20.0 mg置100 ml 量瓶中，加溶劑(色譜甲醇:水=4:1，下同)適量，振搖使對照品溶解，加上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1.0 ml 置10 ml 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3.2 樣品溶液的配制 精密量取環(huán)孢素滴眼液2.0 ml 置100 ml 量瓶中，加溶劑至量瓶刻度2/3 處，超聲15 min，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1.0 ml 置10 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.3 空白溶液的配制 精密量取氫化蓖麻油2.0 ml 按樣品溶液的配制方法制備空白溶液。

1.3.4 色譜條件 流動相為甲醇:水(4.25:1);紫外檢測波長210 nm［4］;色譜柱為C18 柱(250 mm×4.6 mm，10 μm);柱溫40℃［5］;流速0.8 ml/min;進樣量20 μl;保留時間12.5 min。容液色譜圖，見圖1。

圖1 溶液色譜圖

1.3.5 線性關系考察 精密量取對照品儲備液1.0，4.0，5.0，6.0，10.0，16.0，20.0 ml 置7 個50 ml 量瓶中，用溶劑分別稀釋至刻度搖勻，得1～7 號系列溶液，分別依次進樣，記錄圖譜，以峰面積對系列溶液的濃度(μg/ml)進行線性回歸，得回歸方程為A=55827.60395C－7871.570090(r=0.9999;n=7，環(huán)孢素在4～80 μg/ml 范圍內呈良好線性關系。

1.3.6 回收率測定 精取對照品儲備液1、2、3、5、8、10 mL分別置于25 mL 容量瓶中，再分別精密量取已知含量的樣品溶液，混合，加溶劑稀釋至刻度搖勻，配制成6 份不同濃度的溶液，照樣品含量測定項下測定。計算平均回收率為99.8%，RSD 為0.52%，測定結果。見表1。

表1 回收率試驗

1.3.7 樣品含量測定 取上述對照品溶液和樣品溶液各20 μl 注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標一點法，計算制劑中環(huán)孢素的含量。本品含量應該為標示量的90.0%～110.0%.測得3 個批號樣品含量，測定結果。見表2。

表2 樣品標示量百分含量(%)

1.4 刺激實驗［6］選成年家兔4 只，體重2.5～3.0 kg，每天分別于每只兔子的一側眼結膜囊內滴入環(huán)孢素滴眼液0.1 ml，另一側滴入生理鹽水0.1ml，給藥后使兔眼被動閉合10 s，記錄給藥后6，24，48，72 h至7 d 兔眼的局部反應情況。結果表明本品無刺激，眼用安全。

2 結果

2.1 制劑的制備 環(huán)孢素在氫化蓖麻油中溶解緩慢，配制時需在60℃水浴中充分攪拌以縮短制備時間。溫度應嚴格控制在60℃以下以避免環(huán)孢素分解。制備環(huán)孢素滴眼液的過程，如果有水濺入氫化蓖麻油中將影響藥物的穩(wěn)定性，易引起霉變，攪拌不宜過快。

2.2 流動相的選擇 在檢測波長210 nm;柱溫40℃;流速0.8 ml/min 的條件下，分別選用色譜純甲醇:水為Ⅰ(6.38:1)、Ⅱ(5.3:1)、Ⅲ(4:1)、Ⅳ(4.25:1)的流動相，結果環(huán)孢素的保留時間分別為6.8 min，8.0 min，16.2 min，12.5 min。其中Ⅰ、Ⅱ分離度較差，Ⅲ、Ⅳ的分離度較好。故選擇色譜純甲醇:水(4.25:1)為流動相，其保留時間、理論塔板數(shù)、分離度均達到要求且配制方便。

2.3 含量的測定 HPLC 法應用于環(huán)孢素滴眼液含量測定，環(huán)孢素在4～80 μg/ml 范圍內呈良好的線性關系(r =0.9999)，平均回收率為99.81%，RSD 為0.52%。表明專屬性強，分析速度快，準確度和精密度均滿足要求，適用于該制劑的質量控制。

3 討論

以氫化蓖麻油為溶劑采用熱溶法制備環(huán)孢素滴眼液，方法簡單，質量穩(wěn)定。采用HPLC 法測定本品中環(huán)孢素含量，其分析方法專屬性強、分析速度快、結果準確可靠、經濟。考慮本品穩(wěn)定性考察結果與醫(yī)院制劑的特點，該滴眼液效期不能超過1年。

［1］沙 波，齊永貴，葉啟發(fā)，等.肝腸聯(lián)合移植后的免疫抑制治療體會［J］.中華器官移植雜志，2000，21(5):283-284.

［2］袁 成，蔣 華，王景祥，等.兔眼角膜環(huán)孢素A 含量測定及經過程［J］.中國臨床藥學雜志，1998，7(6):287.

［3］周曉慶，張秀華，黃學孫.環(huán)孢素滴眼液的制備及質量控制［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2005，25(6):574-575.

［4］王延東，陳茂玲，葉成添，等.環(huán)孢素眼用乳劑的制備及質量控制［J］.中國實用醫(yī)藥，2010，12(5):7-8.

［5］陳 潔，楊利平，劉春雨，等.高效液相色譜法測定環(huán)抱素滴眼液中環(huán)抱素的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26(3):372-373.

［6］章元沛，主編.藥理學實驗［M］.第2 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:222.