孫 麗，夏日煒，殷學梅，喻禮懷，朱國強，吳圣龍，包文斌*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009)

LPS誘導條件下豬小腸上皮細胞TLR4及其信號通路基因表達變化分析

孫 麗1，夏日煒1，殷學梅1，喻禮懷1，朱國強2，吳圣龍1，包文斌1*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009)

本試驗通過0.1和1 μg·mL-1濃度的LPS誘導處理豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)，分別在2、4、6 h時利用實時熒光定量PCR方法檢測TLR4及其信號通路相關基因(CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β和IFN-α)mRNA水平相對表達量，初步探討豬小腸上皮細胞受到產腸毒素大腸桿菌侵擾發(fā)生炎癥反應的相關分子反應機理。結果發(fā)現，兩種濃度的LPS均使得所檢測的TLR4及其信號通路相關基因表達量上調，誘導后4～6 h的表達量急速上升，且高濃度的LPS誘導處理后各基因表達量上調倍數明顯高于低濃度LPS誘導時各基因表達量上調倍數，高濃度的LPS對機體腸道的刺激引起了更為強烈的免疫反應，使正常機體更快地產生炎癥反應。由此推測，大腸桿菌侵染豬腸道后將釋放LPS，TLR4作為LPS的受體，受LPS誘導其表達量上調，進而引起TLR4信號途徑的信號傳遞，傳遞過程中由于MyD88的依賴機制，MyD88表達量上調相對穩(wěn)定，再經過級聯免疫放大效應，大量的促炎細胞因子釋放，導致炎癥及腹瀉水腫病的產生。

豬；TLR4基因；信號通路；細胞因子

Toll樣受體基因家族(Toll like receptors，TLRs)均屬于I型跨膜蛋白受體，在機體組織細胞如胃腸道和呼吸道等組織中廣泛分布，在機體防御病原體感染中發(fā)揮重要作用。在TLRs龐大家族中，TLR4是LPS識別的主要受體[1]。LPS對哺乳動物細胞的刺激除了TLR4參與外，需要多種蛋白的協同參與，如LPS結合蛋白(LPS binding protein，LBP)、白細胞分化抗原14(Cluster of differentiation antigen 14，CD14)、髓樣分化蛋白-2(Myeloid differentiation protein 2，MD-2)等。其中，CD14是LPS的高親和受體，存在LPS特異識別位點，LPS在LBP的促進作用下結合到CD14，從而CD14將其傳遞給TLR4受體復合物[2-3]。

目前發(fā)現，TLRs信號途徑的接頭蛋白有3種，分別為髓樣分化因子(Myeloid differentiaion factor 88，MyD88)、TIR功能區(qū)的接頭蛋白(TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP或MyD88-adaptor-like，Mal)和β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β，TRIF)。經過MyD88轉導的信號途徑稱MyD88依賴途徑(MyD88-dependent pathway)，其他則稱作MyD88非依賴途徑(MyD88-independent pathway)[4-5]，其分別經過一系列信號轉導鏈，最后活化核轉錄因子(Nuclear factor κb，NF-κB)[6]，活化的NF-κB將信號迅速傳至核內，增強TNF-α和IL-1β的基因轉錄，進一步激活核轉錄因子，使IL-6、IL-8等促炎性細胞因子和I型干擾素(IFN-α，IFN-β)的分泌釋放增多，導致最初的炎癥信號進一步放大，調控相關細胞因子表達，激活中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞，產生細胞因子級聯放大效應，誘發(fā)炎癥反應[7-8]。

產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)屬于革蘭陰性菌，可以引起斷奶仔豬腹瀉(Post-weaning diarrhea，PWD)和水腫病(Edema disease，ED)。ETEC首先黏附到小腸上皮細胞(Intestinal epithelial cell，IEC)并定居于特定腸段，大量繁殖后產生并釋放的腸毒素(Enterotoxin)和內毒素(Lipopolysaccharide，LPS)發(fā)揮病理效應[9]。本試驗基于TLR4信號通路傳遞模式及其重要的生理功能，利用LPS誘導處理豬腸上皮細胞系(IPEC-J2)，檢測TLR4及其信號通路相關基因(CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β、IFN-α)mRNA水平相對表達量，分析LPS誘導條件下TLR4及其信號通路基因的表達變化規(guī)律，探討豬腸上皮細胞受到產腸毒素大腸桿菌侵染發(fā)生炎癥反應的相關分子機理，為今后利用調控TLR4及其信號通路的表達水平來提升仔豬抗大腸桿菌侵染能力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及LPS處理

完全培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基與F12培養(yǎng)基1∶1混合，含10%胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco BRL，Life Technologies，Grand island，NY，USA)培養(yǎng)豬小腸上皮細胞系IPEC-J2(由美國賓夕法尼亞大學惠贈)，長至80%～90%匯合時，用不同濃度(0.1和 1 μg·mL-1)的LPS(Sigma-aldrich，St.Louis，MO，USA)進行誘導，陰性對照組只加用于配置誘導液的細胞培養(yǎng)液，每組有3個平行樣。分別在誘導后的2、4、6 h提取細胞RNA。陰性對照組在培養(yǎng)后的6 h提取細胞總RNA。

1.2 反轉錄及Real-time PCR

按照反轉錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time，TaKaRa，大連，中國)操作程序進行反轉錄，cDNA合成：每10 μL的反應體系中含5×PrimerScript RT Enzyme Mix 2 μL，總RNA不超過500 ng，RNase-free ddH2O補足至10 μL。反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

以cDNA為模板，對基因(TLR4、CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β、IFN-α)表達量進行檢測分析，各基因檢測引物見表1，由生工生物工程有限公司(上海，中國)合成。使用實時熒光定量PCR試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real Time，TaKaRa，大連，中國)，反應體系：10 μL SYBR Premix ExTapTMII(2×)，0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)，0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)，0.4 μL ROX Reference Dye II(50×)，2 μL cDNA，ddH2O補至20 μL。ABI 7500 系統進行實時熒光定量反應的檢測。Real-time PCR擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)；為分析擴增產物的特異性，PCR擴增結束后采集多個信息點進行熔解曲線分析，程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

表1 各基因熒光定量引物

1.3 數據處理與統計分析

基因相對定量的結果采用2-ΔΔCt法進行計算，用內參基因GAPDH對各基因表達水平進行均一化，2-ΔΔCt法計算公式：ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，ΔΔCt =試驗組ΔCt值-參照組ΔCt值[10]。利用 SPSS 16.0 軟件的一般線性模型(General Linear Model，GLM)對各不同處理時間的細胞基因表達差異情況進行比較分析。

2 結 果

2.1 LPS誘導IPEC-J2后不同時間的TLR4信號通路基因表達量差異

設每個基因陰性對照的表達量為1，對TLR4信號通路基因的熒光定量結果進行統計，在0.1 μg·mL-1的LPS誘導后各個基因表達量呈階梯狀增長，如圖1。在LPS誘導后的2 h，各基因表達量都有所升高，但差異均不顯著。誘導后的4 h，除IFN-α外，其余基因表達量都顯著或極顯著高于陰性對照組，其中TLR4和IL-1β的表達量極顯著高于誘導后2 h的表達量(P<0.01)。誘導6 h后，除TLR4基因，其余基因的表達量都極顯著高于陰性對照和誘導后2、4 h的表達量(P<0.01)。

1.0 μg·mL-1的LPS刺激小腸上皮細胞后各基因的表達量在4～6 h急速上升。TLR4和IFN-α的表達量在誘導后的4 h極顯著高于陰性對照組和誘導后2 h試驗組(P<0.01)。在LPS誘導后的6 h，所測通路基因的表達量都與其他組差異極顯著(P<0.01)。同時與0.1 μg·mL-1的LPS相比，所有通路基因的表達水平都大幅度上升(圖2)。

2.2 LPS誘導IPEC-J2后TLR4信號通路不同基因表達量升高倍數的差異

由圖3可知，在0.1 μg·mL-1的LPS誘導后的2 h，TLR4的表達量上調倍數最高；誘導后4 h，TNF-α上調倍數最高，其次為IL-1β，均極顯著高于CD14、TLR4、MyD88和IFN-α(P<0.01)；在誘導后的6 h，IL-1β的表達量上調倍數最高，其次為TNF-α，且同樣均極顯著高于CD14、TLR4、MyD88(P<0.01)，顯著高于IFN-α(P<0.05)；IFN-α上調倍數顯著增加，極顯著高于MyD88(P<0.01)，顯著高于TLR4(P<0.05)。

NC.陰性對照。*.P<0.05；**.P<0.01。下圖同NC.Represents negative control.*.P<0.05；**.P<0.01.The same as below圖1 0.1 μg·mL-1 LPS誘導IPEC-J2后TLR4信號通路基因的表達量Fig.1 Genes expression of TLR4 pathway in IPEC-J2 induced by 0.1 μg·mL-1 LPS

圖2 1.0 μg·mL-1 LPS誘導IPEC-J2后TLR4信號通路基因的表達量Fig.2 Genes expression of TLR4 pathway in IPEC-J2 induced by 1.0 μg·mL-1 LPS

圖3 0.1 μg·mL-1 LPS誘導后TLR4信號通路基因的表達量比較Fig.3 The comparison of expression among the genes of TLR4 pathway induced by 0.1 μg·mL-1 LPS

由圖4可知，在1.0 μg·mL-1LPS誘導后的2 h，TNF-α的表達量上調倍數最高；在誘導后的4 h，IFN-α的表達量上調倍數最高，其次為TNF-α，均極顯著高于CD14、TLR4、MyD88和IL-1β(P<0.01)；IL-1β的表達量上調倍數顯著高于CD14(P<0.05)，且極顯著高于MyD88(P<0.01)；在誘導后的6 h，IFN-α的表達量上調倍數仍保持最高，其次為IL-1β，極顯著高于CD14、TLR4、MyD88和TNF-α；IL-1β的表達量上調倍數急劇增加，其次為TNF-α(P<0.05)，且極顯著高于CD14、TLR4和MyD88(P<0.01)，TNF-α的表達量上調倍數極顯著高于CD14、TLR4和MyD88上調趨勢依次從高到低。

圖4 1.0 μg·mL-1 LPS誘導后TLR4信號通路基因的表達量比較Fig.4 The comparison of expression among the genes of TLR4 pathway induced by 1.0 μg·mL-1 LPS

3 討 論

TLR4是天然免疫系統中的跨膜受體，可非特異性與病原相關分子結合，接受LPS等多種炎癥信號啟動機體炎癥反應。MyD88是TLR4信號通路中的一個關鍵接頭分子，與NF-κB構成炎癥反應通路，TLR4通路在傳遞炎癥信號和增強炎癥強度，引發(fā)腸道炎癥介質的釋放中具有重要的作用[11]。小腸上皮細胞是豬抵抗腸道致病菌的第一道防線，是與革蘭陰性菌的LPS直接作用的細胞，它的病變將會導致仔豬的腹瀉和水腫等癥狀的出現。本試驗用LPS體外誘導IPEC-J2，結果TLR4信號通路的基因及其效應因子的表達量都隨誘導時間的推移而顯著上調，而且在誘導后的6 h都與陰性對照呈極顯著差異(P<0.01)。這與相關研究結果類似，LPS的刺激會引起豬小腸上皮細胞內細胞因子的表達上調[12]，LPS免疫應激可以上調母兔TLR4、IL-1β和IL-6在下丘腦中以及IL-1β和IL-6在卵巢、輸卵管中的表達量[13]，M.Moue等的研究也表明，LPS誘導后腸上皮細胞內TLR4的表達量顯著上調[14]。相關研究均說明了TLR4的基因上調是促使炎癥產生的關鍵。本研究用豬小腸上皮細胞系(IPEC-J2)來研究LPS與宿主的相互作用，可以在細胞水平探討TLR4信號通路對于仔豬大腸桿菌疾病的抗性調控機制，進一步證明，TLR4免疫通路受LPS誘導激活，并在長時間作用下使此免疫通路信號不斷增強，提示在豬體內TLR4及其信號通路參與了LPS感染并引起癥狀的過程。

細胞因子是由免疫原、絲裂原或其他因子刺激細胞所產生的低分子量可溶性蛋白質，為生物信息分子，具有調節(jié)固有免疫和適應性免疫應答，促進造血，以及刺激細胞活化、增殖和分化等功能[15]。TNF-α是炎癥反應過程中出現最早、最重要的炎性介質，使血管內皮細胞通透性增加，調節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細胞因子的合成和釋放，誘導MHCⅡ類抗原在結腸上皮中的表達[16]。同時，TNF-α還可誘導結腸上皮細胞凋亡，促進潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)的發(fā)生。IL-1β可以增強細胞免疫和體液免疫介導的組織損傷過程，趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道病變部位，引起一系列腸道炎癥反應和組織破壞。丁偉群等發(fā)現IL-1β在潰瘍性結腸炎患者受累腸黏膜上顯著升高，未受累黏膜IL-1β也明顯高于正常組，說明IL-1β確實參與UC的發(fā)生發(fā)展過程[17]。IFN-α可促進大多數細胞MHCI類抗原的表達，活化NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞，引起機體的免疫反應，起到抗病毒作用，來維持機體正常水平[18]。本研究結果顯示，LPS誘導后的4 h開始，細胞免疫因子TNF-α、IL-1β和IFN-α的mRNA表達量上調的倍數都顯著或極顯著高于其他基因。可見，LPS先是誘導膜蛋白CD14和TLR4的mRNA表達，再通過依賴MyD88或非依賴MyD88的信號途徑傳遞，最終導致細胞因子的mRNA成放大倍數的增長，這也很好的體現了細胞免疫的級聯放大機制。推測機體內的免疫效應就是通過此級聯瀑布效應來應激LPS所介導腸道內致病性細菌的附著和侵染，進而導致腸道內炎癥的產生及仔豬的腹瀉和水腫等癥狀的出現。用兩種濃度的LPS來誘導IPEC-J2，1.0 μg·mL-1濃度的LPS刺激后使TLR4信號通路各基因mRNA的表達量明顯高于0.1 μg·mL-1濃度LPS誘導時各基因mRNA的表達量。由此推測，相對較高濃度的LPS對機體腸部的刺激會帶來更強烈的免疫反應，使正常機體更快速的產生炎癥反應，以致仔豬嚴重的腹瀉和水腫。M.Moue等的研究表明，0.25 μg·mL-1的LPS會引起腸上皮細胞TLR4 mRNA的表達顯著上調(P<0.05)，而0.025或5 μg·mL-1濃度的LPS均未引起TLR4 mRNA的顯著上調[14]。本試驗所選擇LPS濃度恰好在這兩者之間，所得試驗結果與其相互補充。另外，無論是0.1 μg·mL-1或是1.0 μg·mL-1濃度的LPS來誘導小腸上皮細胞，MyD88基因表達的增長倍數都為最低，這可能與此通路對MyD88的依賴性有關，MyD88 mRNA水平的表達量表現為相對穩(wěn)定，以此來確保機體的代謝穩(wěn)定。

已有研究表明，TLR4基因的表達水平往往與各種炎癥反應相關，H.Hammad等發(fā)現，吸入屋塵螨提取物后，呼吸道上皮細胞表達的TLR4 能夠活化樹突狀細胞導致過敏性炎癥[19]；E.Cario研究發(fā)現腸炎病人TLR4表達上調[20]。本課題組前期研究表明，TLR4基因表達水平的下調可以提高斷奶仔豬對于F18大腸桿菌的抗性[21]；本試驗結果進一步證實了TLR4及其信號通路基因表達水平對于豬大腸桿菌抗性存在調控作用，提示，下一步在繼續(xù)深入研究TLR4信號通路對于豬大腸桿菌抗性調控機理的基礎上，可以考慮利用RNAi等手段，系統研究下調和干擾TLR4及其信號通路的表達是否可以提升仔豬對于大腸桿菌侵染能力，為豬大腸桿菌病的抗病育種工作提供新的方法和策略。

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(編輯 郭云雁)

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Analysis of Differential Expression ofTLR4 and TLR4 Signaling Pathway Genes under Lipopolysaccharide-induced Pig Intestinal Epithelial Cells

SUN Li1，XIA Ri-wei1，YIN Xue-mei1，YU Li-huai1，ZHU Guo-qiang2，WU Sheng-long1，BAO Wen-bin1*

(1.KeyLaboratoryforAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

In this study，we exposed pig intestinal epithelial cells (IPEC-J2) to 0.1 and 1 μg·mL-1LPS for 2，4 and 6 h，respectively.Then，we estimated the relative mRNA expression ofTLR4 and TLR4 signaling pathway-related genes (CD14，MyD88，TNF-α，IL-1β，IFNα) using qPCR，which preliminary revealed the mechanism of the molecules related to inflammatory reactions in pig intestinal epithelial cells induced by enterotoxigenicEscherichiacoli.Both concentrations of LPS upregulated the expression ofTLR4 and its signaling pathway-related genes，and the expression level of all genes sharply increased from 4 to 6 h.The fold change of mRNA expression induced by 1.0 μg·mL-1LPS was significantly higher than that induced by 0.1 μg·mL-1LPS.The former stimulated the intestinal tract to produce stronger immune responses and more rapid development of inflammatory reactions.Above results suggested that LPS was released in the pig intestinal tract withE.coliinfection，and upregulated the LPS receptor TLR4，leading to activation of the TLR4 signaling pathway.Given the dependency on myeloid differentiation factor 88 (MyD88) during signaling，stable upregulation ofMyD88 and the cytokine cascade results in the release of large amounts of proinflammatory cytokines，causing inflammatory reactions，diarrhea and edema disease.

swine；TLR4 gene；signaling pathway；cytokines

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.003

2014-09-28

國家自然科學基金(31372285；31172183)；江蘇省高校自然科學研究重大項目(14KJA230003)；轉基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08006-001B)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)

孫 麗(1992-)，女，江蘇如皋人，碩士生，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：sl19920327@163.com

*通信作者：包文斌，博士，研究員，主要從事豬抗病育種研究，E-mail：wbbao@yzu.edu.cn

S828.2

A

0366-6964(2015)07-1095-07