馬煥班，劉先先，楊 杰，黃衛(wèi)兵，段艷宇，郭源梅，麻駿武

(江西農(nóng)業(yè)大學豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330045)

豬IRS4基因多態(tài)性、表達差異及其與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

馬煥班，劉先先，楊 杰，黃衛(wèi)兵，段艷宇，郭源梅*，麻駿武*

(江西農(nóng)業(yè)大學豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330045)

本研究旨在檢測豬IRS4基因多態(tài)性及其在17種組織中的表達水平，尋找基因內(nèi)與脂肪沉積性狀QTL效應相關(guān)的分子標記。本研究采用比較測序方法搜尋到IRS4基因的3個SNPs，分別是在啟動子上的g.96C>G，外顯子上的同義突變g.1829T>C和錯義突變g.1794T>C(p.Phe432Leu)。RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，IRS4基因在垂體、下丘腦中高度表達，在其他組織中弱表達或不表達。在白色杜洛克×二花臉F2資源家系、蘇太豬群體、二花臉群體、杜長大三元雜商品豬及中國地方野豬中，用PCR-RFLP方法對IRS4的3個SNPs位點進行判型，然后分析它們的基因頻率及其與4點(肩、胸、腰、臀部)背膘厚、腹脂重、肌內(nèi)脂肪含量和眼肌面積的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.96C>G位點在F2家系(含有SSCX QTL)中分離程度很低，被首先排除作為潛在因果突變(QTN)的可能性。g.1794T>C和g.1829T>C位點在所有檢測的西方豬種(白色杜洛克和杜長大)是均為TT基因型，而它們的CC基因型頻率在二花臉豬中分別為65%和100%。在不同群體中標記關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，g.1794T>C與F2個體所有脂肪沉積表型均極顯著相關(guān)(P<0.01)，但它在蘇太豬中僅與IMF顯著相關(guān)(P<0.05)，且與二花臉豬表型關(guān)聯(lián)不顯著(P>0.05)；g.1829T>C則不僅與F2個體所有脂肪沉積表型均極顯著相關(guān)(P<0.01)，而且與蘇太豬的4點膘厚和眼肌面積呈顯著或極顯著相關(guān)。此外，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，g.1794T>C錯義突變可能對IRS4蛋白的功能影響不大。結(jié)果提示，該錯義突變也不太可能是影響脂肪沉積的QTN，而g.1829T>C與F2和蘇太豬的脂肪沉積性狀都顯著關(guān)聯(lián)，故其可作為這些性狀選育的分子標記，并值得深入研究。

豬；IRS4基因；QTL；多態(tài)性；表達差異；脂肪沉積性狀

脂肪沉積性狀是豬生產(chǎn)及育種中最為重要的經(jīng)濟性狀指標之一。豬皮下脂肪的含量，如背膘厚度和腹脂重，主要決定胴體品質(zhì)；而肌內(nèi)脂肪含量(IMF)主要影響豬肉的嫩度、多汁性及加工后的風味等肉質(zhì)特征。

國內(nèi)外多個研究小組利用不同西方豬種和中國地方品種梅山豬為祖代雜交構(gòu)建的資源家系，先后在豬X號染色體近著絲粒區(qū)域上定位到了與豬脂肪沉積、生長和胴體組成等性狀相關(guān)的數(shù)量性狀位點(QTL)。D.Milan等[1]利用所構(gòu)建的大白和梅山豬資源家系，在X染色體上標記SW1994附近檢測到了顯著影響眼肌重和背膘重的QTL區(qū)域，該QTL效應分別可以解釋36%(眼肌重)和41%(背膘重)的表型變異。H.Ai等[2]利用白色杜洛克(白杜)×二花臉資源家系F2群體，也在SW1994周邊定位到了與脂肪沉積性狀相關(guān)的QTL。J.Ma等[3]曾發(fā)現(xiàn)該QTL區(qū)域內(nèi)存在一個較大的重組冷點區(qū)(約34 Mb)，這使得利用傳統(tǒng)的精細定位方法很難進一步縮小QTL的置信區(qū)間。M.Perez-Enciso等[4]對來自6個品種(野豬、梅山、大白、長白、伊比利亞、皮特蘭)和5個雜交系約3 000頭個體的合并分析，發(fā)現(xiàn)有利于脂肪沉積的基因起源于亞洲豬種，區(qū)間界定在SW1994～SW1943區(qū)域。S.Cepica等[5-7]對利用以野豬和梅山為基礎(chǔ)的資源家系通過增加標記密度同樣將該QTL精細定位于SW1994～SW1943，且QTL最高峰位于IRS4和ACSL4基因周邊。本研究組與法國Milan組合作通過合并分析白杜×二花臉資源家系F2群體和法國INRA大白×梅山資源家系群體背膘厚QTL的置信區(qū)間縮小至6～7 cM，區(qū)域內(nèi)包含ACSL4、SERPINA7(TBG)、IRS4等幾個重要的位置候選基因[8]。

IRS4基因編碼胰島素受體底物-4，并在下丘腦組織中高度表達[9]。有研究表明，胰島素受體底物-4會耦合到瘦素受體上，而瘦素和胰島素都能夠通過作用于下丘腦神經(jīng)元調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的能量消耗和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，從而參與控制食物攝入，長期控制肥胖，促性腺激素的分泌以及繁殖性能的調(diào)控[10-11]。因此，IRS4基因的多態(tài)性可能引起脂肪沉積表型變異，是SSCX QTL區(qū)域內(nèi)值得研究的候選基因。

S.Cepica等[5-7]利用比較測序方法，在IRS4基因啟動子區(qū)和外顯子區(qū)分別搜尋到g.96C>G和g.1829T>C(GenBank：FN424076.1)兩個多態(tài)位點(SNPs)；并在梅山×大白資源家系F2群體中發(fā)現(xiàn)這兩個SNPs與背膘均存在極顯著關(guān)聯(lián)性，且1829T>C與眼肌深度存在顯著關(guān)聯(lián)性[12]。J.Ma等[8]在對脂肪沉積候選基因的研究中，檢測了這兩個位點在法國農(nóng)業(yè)科學研究院(INRA)所構(gòu)建的大白×梅山家系F0和F1代個體中的基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.96C>G位點等位基因G僅來源于梅山豬，但其在祖代梅山豬的頻率很低(≤0.08)，而g.1829T>C位點在所檢測的梅山豬和大白豬分別只攜帶等位基因C和T。

豬IRS4基因與人IRS4基因(NM_003604)具有高度同源性，其編碼序列與人IRS4基因編碼序列相似度為87%，基因所編碼的含1 269個氨基酸的蛋白序列(CAZ66650.1)與人IRS4基因編碼的含1 257個氨基酸蛋白序列(AAC51738.1)具有92%的高度同源性。因此，分析候選基因IRS4與目標QTL之間的關(guān)系，有助于揭示豬脂肪沉積性狀的分子遺傳機理，并為人類肥胖病遺傳研究提供一定的借鑒。

本研究以豬IRS4基因作為SSCX QTL位置候選基因，先通過比較測序，對豬IRS4外顯子區(qū)域進行SNPs篩查，再在白杜×二花臉F2群體、蘇太豬(杜洛克和二花臉雜交18代以上的培育品種)及二花臉豬群體中分析該基因SNPs與豬脂肪沉積性狀的相關(guān)性，以期鑒別與豬脂肪沉積性狀相關(guān)聯(lián)的分子標記，為今后豬育種的標記輔助選擇提供確切的遺傳學證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物包括1個本實驗室前期構(gòu)建的白杜×二花臉資源家系F2群體、1個蘇太豬群體(522頭)和1個純種二花臉豬群體(336頭)。其中，F(xiàn)2資源家系群體是以2頭白杜公豬和17頭二花臉母豬雜交，產(chǎn)生9頭F1公豬和59頭F1母豬，再由這些F1代個體隨機交配(避免全同胞交配)產(chǎn)生1 912個F2個體而成的。蘇太豬群體和二花臉豬群體分別分批購自于蘇州市蘇太豬育種中心和江蘇省常州市焦溪二花臉豬專業(yè)合作社，購買時仔豬均在2～3月齡左右，之后被運至實驗室租賃的豬場(位于江西省南昌市郊區(qū))，并配以相同的飼養(yǎng)模式進行隔離飼養(yǎng)。試驗動物在達到所要求的日齡后，均按生豬標準化屠宰程序進行屠宰，同時進行相關(guān)表型的測定。

此外，本研究中還檢測了50頭杜長大三元雜商品豬和15頭中國野豬個體的基因型，所檢測個體的DNA樣本均來源于本實驗室基因庫。

1.2 方法

1.2.1 表型測定與DNA樣本制備 表型測定則由專人負責以減少系統(tǒng)誤差，詳細測定過程見參考文獻[13]。本研究所測定的肉質(zhì)性狀包括：4點背膘厚(Backfat depth)、肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)含量、眼肌面積(Loin eye area，LEA)、腹脂重(Abdomental weight)和后腿重(Ham weight)。用游標卡尺測定240日齡屠宰個體右邊胴體4點背膘厚(肩部為頸椎與胸椎結(jié)合處，胸部為第6～7胸椎處，腰部為最后肋骨處，臀部為腰薦結(jié)合部)。肌內(nèi)脂肪含量測定使用索氏脂肪抽提法進行測定。眼肌面積的測量采用硫酸方格紙描繪、Leica軟件進行計算的方法。腹脂重、后腿重采用電子天平進行稱量。

屠宰個體樣本采集同樣按采樣規(guī)范操作，用耳號鉗夾取30～40 mg的耳組織樣本，裝在含1 mL 75%酒精的Eppendorf 離心管內(nèi)，-20 ℃保存。

采用苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法從耳組織中提取全基因組DNA，Nanodrop-1000用于檢測DNA樣本質(zhì)量。本試驗中按20 ng·μL-1的濃度標準在96孔板中制成DNA模板備用。

1.2.2 SNPs的搜尋 參考NCBI所提供的豬IRS4基因序列(GenBank：FN424076.1)設計4對測序引物進行測序，擴增片段覆蓋IRS4基因約3 300 bp的序列，引物的設計采用Premier5.0軟件，引物均由上海生工合成，引物序列、退火溫度等詳細信息見表1。

選取2頭杜洛克和4頭二花臉個體的DNA為模板，進行PCR擴增。采用改良型的降落PCR(Touch down PCR)擴增程序進行擴增，PCR反應體系為25 μL：40 ng基因組DNA、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.2 μmol·L-1的引物、1.5 mmol·L-1Mg2+，1×PCR緩沖液和2UTaqDNA聚合酶(TaKaRa)。降落PCR程序：94 ℃預變性5 min；然后進入PCR擴增程序，94 ℃變性30 s，68～54 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，每降1 ℃循環(huán)2次，共28個循環(huán)；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，19次循環(huán)；72 ℃延伸1 min，最后降至4 ℃。所得到的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果采用DNAStar軟件包的Seqman程序進行分析，通過序列比對鑒定該片段上存在的多態(tài)位點。

1.2.3 SNPs的基因型檢測 使用PCR-RFLP方法檢測多態(tài)位點基因型，使用Primer5.0軟件設計引物，在IRS4基因3個多態(tài)位點附近區(qū)域進行擴增，引物信息如表2所示。PCR反應體系25 μL：40 ng基因組DNA、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.2 μmol·L-1的引物、1.5 mmol·L-1Mg2+，1×PCR緩沖液和2 UTaqDNA聚合酶。PCR程序設計同樣為降落PCR：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，68～54 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，每降1 ℃循環(huán)2次；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，19次循環(huán)；72 ℃延伸1 min，最后降至4 ℃。

擴增產(chǎn)物用于酶切基因判型。15 μL的酶切反應體系中包含PCR產(chǎn)物5 μL，限制性內(nèi)切酶2 U，10×緩沖液1.5 μL和去離子水8.3 μL，37或65℃溫育6 h，反應產(chǎn)物經(jīng)4.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從而判斷這3個位點的基因型。PCR-RFLP中所使用的限制性內(nèi)切酶、溫育溫度和基因型片段大小如表2所示。

表1 SNP搜尋引物序列及相關(guān)信息

表2 PCR-RFLP方法判定IRS4基因SNPs基因型

1.2.4 組織表達分析 利用半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)分析不同組織中IRS4基因表達情況，基因組織表達的17種組織：腎上腺、腎、肺、垂體、卵巢、板油、前列腺、睪丸、心、胸腺、附睪、小腸、胃、甘油、下丘腦、甲狀腺、膀胱。所設計的引物序列如表3所示，采用GAPDH看家基因作為反應內(nèi)參。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測IRS4基因在不同基因型母豬下丘腦組織表達差異情況，所設計的引物擴增區(qū)域包含外顯子的兩個突變位點，引物信息如表3所示。

1.2.5 統(tǒng)計分析 利用SAS軟件的MIXED過程確定分析模型中分別需要考慮的固定效應和協(xié)變量，結(jié)果將性別和批次作為固定效應，而將胴體重作為協(xié)變量，用基因型親緣系數(shù)剔除多基因效應。對不同群體SNP多態(tài)性基因型及單倍型與表型進行關(guān)聯(lián)分析，分析模型為加性效應模型，模型：

y=μ+sex+batch+Cw+gkin+snp/hapo+e

表3 RT-PCR引物信息

其中，y表示表型值，μ為群體平均值，sex和batch分別表示性別和批次，為固定效應，C胴體重回歸系數(shù)，w為胴體重協(xié)變量，gkin表示基于基因型的個體間親緣關(guān)系，snp/hapo為候選基因SNP效應或SNP所構(gòu)建的單倍型效應，e表示殘差。基因位點與表型之間的關(guān)聯(lián)性是基于模型進行判別，如果關(guān)聯(lián)性P值達到或超過顯著水平的臨界值，說明該位點為顯著關(guān)聯(lián)位點。

2 結(jié) 果

2.1 SNPs搜尋

通過序列比對，搜尋到了3個SNPs位點，其中兩個位點(啟動子上的g.96C>G位點和一個同義突變位點g.1829T>C)與此前報道相一致；第3個位點為新發(fā)現(xiàn)的位點，它位于同義突變位點g.1829T>C的5′端上游35 bp處，是一個錯義突變g.1794T>C(p.Phe432Leu)，該位點突變導致相應的氨基酸由苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼帷?/p>

2.2 多態(tài)位點的判型與基因型分布頻率

使用PCR-RFLP方法判定IRS4基因3個SNPs的基因型。使用限制性核酸內(nèi)切酶Fnu4HI、AluI和BsmFI分別對g.96C>G、g.1794T>C和g.1829T>C這3個位點PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，各位點基因型判定結(jié)果見圖1。

A.限制性內(nèi)切酶Fnu4HI對g.96C>G分型結(jié)果：7、8.CC；1、3、6.GG；2、4、5.CG。B.AluI對g.1794T>C分型結(jié)果：2、3.CC；1、6、7、8.TT；4、5.CT。C.BsmFI對g.1829T>C分型結(jié)果：1、3、4.CC；5、8.TT；2、6、7.CT。M.DNA相對分子質(zhì)量標準A.Genotyping results for g.96C>G were obtained by Fnu4HIrestriction enzyme digestion：CC.7，8；GG.1，3，6；GG.2，4，5.B.Genotyping results for g.1794T>C were obtained by AluIrestriction enzyme digestion：CC.2，3；TT.1，6，7，8；CT.2，6，7.C.Genotyping results for g.1829T>C were obtained by BsmFIrestriction enzyme digestion：CC.1，3，4；TT.5，8；CT.2，6，7.M.50 bp ladder DNA marker圖1 IRS4基因3個多態(tài)位點酶切分型結(jié)果Fig.1 The RCR-RFLP-based genotyping results for the 3 IRS4 SNPs

基于上述標準，分別在各研究群體中對這3個位點進行判型，各群體中多態(tài)位點的等位基因型頻率統(tǒng)計信息見表4。其中，g.96C>G位點在資源家系F0代個體中分離程度較低，僅有2頭二花臉母豬為CG型，另外2頭白杜公豬和15頭二花臉母豬均為CC型，所檢測的15頭野豬個體也全為CC型。g.1794T>C位點等位基因C在資源家系F0代中僅來源于二花臉母豬，2頭白杜公豬和另外檢測的50頭杜長大三元雜商品肉豬全為TT型。g.1829T>C位點在所有檢測的純種二花臉豬中都為CC型；而在F0代白杜和杜長大三元雜商品豬中都為TT型，野豬群體中沒有檢測出TT基因型。

表4 3個SNP位點在不同群體中的基因型分布頻率

2.3IRS4在17種不同組織中表達差異性分析

試驗結(jié)果表明(圖2)，在豬的17種不同組織cDNA樣品中，IRS4基因在垂體、下丘腦高度表達，在卵巢、板油、睪丸、甲狀腺中弱表達，在其它組織中微弱或不表達。

1.腎上腺；2.腎；3.肺；4.垂體；5.卵巢；6.板油；7.前列腺；8.睪丸；9.心；10.胸腺；11.附睪；12.小腸；13.胃；14.肝；15.下丘腦；16.甲狀腺；17.膀胱；M.DNA相對分子質(zhì)量標準1.Adrenal；2.Kidney；3.Lung；4.Pituitary；5.Ovary；6.White adipose tissue；7.Prostate；8.Testis；9.Heart；10.Thymus；11.Epididymis；12.Small intestine；13.Stomach；14.Liver；15.Hypothalamus；16.Thyroid；17.Bladder；M.50 bp ladder DNA marker圖2 IRS4基因在豬17種組織中的表達差異Fig.2 The expression pattern of IRS4 gene in 17 porcine tissues

根據(jù)錯義突變位點g.1794T>C的分型結(jié)果，選取CC和CT基因型F2母豬各6頭(無TT型母豬樣品)，分析IRS4基因在下丘腦組織中的表達差異情況。結(jié)果顯示(圖3)，CC基因型個體IRS4平均表達量高于CT型，分別為(2.07±4.45)和(0.95±0.43)，但兩者差異不顯著(P=0.15)。這可能是由于檢測個體數(shù)偏少，且同種基因型個體基因表達差異也較大的緣故。

2.4 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

由于g.96C>G位點在資源家系F0代個體中分離程度較低，白杜和二花臉的主等位基因都為G，這與SSCX上脂肪沉積性狀QTL等位基因在兩個祖代品種各自趨近純合估計不符，因此排除了該位點作為影響豬脂肪沉積因果突變位點(QTN)的可能性。在后續(xù)的分析中，集中探討了g.1794T>C和g.1829T>C與脂肪沉積性狀的相關(guān)性。

圖3 比較g.1794T>C位點CC和CT基因型個體的下丘腦組織中IRS4基因的表達差異Fig.3 The difference in expression level of IRS4 gene in porcine pituitary tissue between pigs with CC and CT genotypes for g.1794T>C

2.4.1 多態(tài)位點g.1794T>C和g.1829T>C與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析 在資源家系F2群體、蘇太豬群體和純種二花臉豬群體中，分析了IRS4基因多態(tài)位點g.1794T>C和g.1829T>C與脂肪沉積性狀的相關(guān)性(表5)，結(jié)果表明，錯義突變g.1794T>C與F2群體所有脂肪沉積性狀均極顯著相關(guān)(P<0.01)，僅與蘇太豬群體IMF顯著相關(guān)(P<0.05)，但與二花臉豬群體所有脂肪沉積性狀相關(guān)性均不顯著；g.1829T>C與F2群體所有脂肪沉積性狀均極顯著相關(guān)(P<0.01)，且與蘇太豬群體4點膘厚、眼肌面積和后腿重顯著或極顯著相關(guān)。因g.1829T>C在純種二花臉中不分離，所以無法在二花臉豬中檢測該位點的效應。

2.4.2 F2與蘇太群體中IRS4單倍型關(guān)聯(lián)分析 根據(jù)g.1794T>C和g.1829T>C在資源家系F0代中的基因型判定結(jié)果，推出兩個位點的相互強連鎖(r2= 0.91)，并構(gòu)建了C-C、T-T、T-C共3種單倍型。其中T-C、C-C單倍型來源于二花臉母豬，頻率分別為0.18和0.82，T-T單倍型則全部來源于白杜公豬。在蘇太群體F0代中，共構(gòu)建出了G-T-C、C-T-T、C-T-C、C-C-C 4種單倍型，其中G-T-C、C-C-C、C-T-C及C-T-T單倍型來源于二花臉母豬，頻率分別為0.29、0.15、0.13和0.43，C-T-T及C-T-C來源于白杜。

在F2群體中，對上述3種單倍型與四點膘厚、腹脂重和肌內(nèi)脂肪含量做相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表6)，二花臉起源的單倍型T-C與C-C效應相近(P> 0.05)，且均與杜洛克起源的T-T單倍型效應差異顯著(P<0.05)，提示在F2群體中g(shù).1829T>C位點比g.1794T>C位點更符合QTL等位基因分離特征或與QTN的連鎖不平衡程度更高。在蘇太群體中，根據(jù)4種單倍型與四點背膘、腹脂重和肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表7)，單倍型主要對臀部膘厚與肌內(nèi)脂肪含量是有顯著影響的。

3 討 論

有關(guān)豬脂肪沉積性狀的基因定位和候選基因研究，國內(nèi)外已有大量的報道[13-16]。已知的影響豬脂肪沉積性狀的QTL主要集中在2、4、6、7、X染色體上，但迄今為止僅少數(shù)主效基因(如IGF2)被證實[17]。X染色體上與豬脂肪沉積、生長和胴體組成等性狀相關(guān)的QTL大多定位在近著絲粒區(qū)域，但是由于在該區(qū)域存在重組冷點區(qū)，使得利用傳統(tǒng)的精細定位方法很難進一步縮小QTL區(qū)間。而且，X染色體存在失活、異質(zhì)性和性染色體劑量補給等現(xiàn)象，這使得對哺乳動物性染色體的QTL和功能基因研究比常染色體更加困難。目前，X染色體上影響豬脂肪沉積性狀QTL的幾個候選基因(包括AR、SERPINA7、ACSL4等[18-21])的研究相對較多，但有關(guān)豬IRS4基因的研究相對較少。而在人類研究中，IRS4基因多與Ⅱ型糖尿病、代謝紊亂、精神分裂癥等疾患相聯(lián)系。據(jù)報道，缺乏IRS4的小鼠會表現(xiàn)出生長、繁殖和糖代謝輕度缺陷[22-24]。

表5 豬IRS4基因兩個SNPs位點與3個試驗群體公豬的脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

表6 在F2群體中IRS4單倍型與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

表7 在蘇太群體中IRS4單倍型與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

本試驗采用DNA比較測序方法，對IRS4基因外顯子區(qū)域約3 300 bp片段進行了多態(tài)位點搜查。結(jié)果除搜尋到了1個S.Cepica等[5-7]所報道同義突變位點g.1829T>C，還搜尋到了1個錯義突變位點g.1794T>C，該位點的突變導致該蛋白質(zhì)第432位氨基酸由苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?Phe432Leu)。然而，這兩個位點均位于該基因外顯子非保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

組織表達差異分析結(jié)果顯示IRS4基因在垂體、下丘腦高豐度表達、在卵巢、板油、睪丸以及甲狀腺弱表達，在其它組織中微弱或不表達，提示IRS4可能與垂體和下丘腦激素分泌有關(guān)，從而影響神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。由于錯義突變可能通過影響蛋白質(zhì)的翻譯機制來影響基因的表達，本研究根據(jù)錯義突變位點g.1794T>C的分型結(jié)果，選擇了資源家系F2母豬CC、CT兩種基因型個體的下丘腦組織分析其表達差異情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)個體間的基因表達差異均較大?？赡艿脑蚴腔虻谋磉_本身存在一定的時空性，或者，由于屠宰時個體的應激程度不同，體內(nèi)激素水平的差異也可能會引起基因的表達差異。另外，除結(jié)構(gòu)突變，基因調(diào)節(jié)元件突變、甲基化和miRNA等其它變異也可能導致基因表達差異，甚至影響表型。

本研究還在不同群體中分析IRS4基因3個SNPs的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，啟動子上的g.96C>G突變在中西方豬種中其主等位基因相同(表4)，這不符合先前對SSCX QTL兩個等位基因在F0代白杜和二花臉品種各自趨近純合的判斷，因此它不被視作潛在的QTN，可以被首先排除。錯義突變位點g.1794T>C在所檢測的資源家系F0白杜及杜長大商品豬種中均為TT基因型，在蘇太豬和二花臉群體中則表現(xiàn)出偏態(tài)分布；其中，蘇太豬TT基因型頻率達到0.84，接近其祖代杜洛克的TT基因型頻率，提示該位點可能與表型存在一定的關(guān)聯(lián)性，并在品種培育過程中受到了一定強度選擇。在同義突變位點g.1829T>C上，西方豬種均為TT基因型，而二花臉豬均為CC基因型，這與QTL等位基因在中西豬種中分離特征相近?；诖?，作者進一步對IRS4基因這兩個位點與脂肪沉積性狀開展關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，在資源家系F2群體中，這兩個位點均與脂肪沉積表型極顯著相關(guān)，表明在該群體中它們與QTL因果突變(QTN)強連鎖。然而，在蘇太和二花臉群體中，錯義突變g.1794T>C對它們的脂肪沉積性狀影響基本不顯著。反而是，同義突變g.1829T>C與蘇太公豬多數(shù)脂肪沉積性狀呈顯著相關(guān)，所以今后需要進一步研究分析它是否具有調(diào)節(jié)功能。同時，我們根據(jù)這兩個位點在資源家系中的分型結(jié)果，構(gòu)建了來源于F0代杜洛克公豬的T-T單倍型和來源于二花臉母豬的C-C、T-C兩種單倍型。在資源家系F2群體中，通過單倍型關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)T-C單倍型與C-C單倍型效應相近，都能增加脂肪沉積，類似于QTL等位基因“Q”，而T-T單倍型則作用相反，可減少脂肪沉積，相當于QTL等位基因“q”。因此，這一結(jié)果提示，同義突變位點g.1829T>C與QTL等位基因分離更一致。此外，T-C單倍型表型值略高于C-C單倍型(P>0.05，表6)，這說明最好是利用兩個突變位點構(gòu)成的單倍型作為脂肪沉積性狀分子育種標記。

4 結(jié) 論

本研究運用DNA比較測序方法，對豬IRS4基因外顯子區(qū)域約3 300 bp片段進行了單核苷酸多態(tài)性檢測，結(jié)果在IRS4基因外顯子區(qū)域鑒別到一個錯義突變g.1794T>C和一個同義突變g.1829T>C。IRS4基因在垂體、下丘腦組織中高豐度表達，而且不同個體下丘腦組織中IRS4基因表達量差異也較大。PCR-RFLP檢測結(jié)果表明g.96C>G在中西方豬種中其主等位基因相同，g.1794T>C和g.1829T>C位點在中西方豬種中存在一定的偏態(tài)分布，在中外雜交豬群中這兩個位點與脂沉積表型存在顯著的相關(guān)性，因此，可以將兩者構(gòu)成的單倍型應用于脂肪沉積性狀的分子育種中。

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(編輯 郭云雁)

PorcineIRS4 Gene：Polymorphism，Differential Expression and Its Associations with Fat Deposition Traits

MA Huan-ban，LIU Xian-xian，YANG Jie，HUANG Wei-bing，DUAN Yan-yu，GUO Yuan-mei*，MA Jun-wu*

(NationalKeyLaboratoryforSwineGenetics,BreedingandProductionTechnology，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China)

This study aimed to detect polymorphisms of porcineIRS4 gene and its expression pattern in 17 tissues，and to identify gene markers associated with the QTL for fat deposition traits.Comparative sequence analysis of theIRS4 revealed 3 SNPs，including g.96C>G in the promoter region，a synonymous substitution g.1829T>C and a missense substitution g.1794T>C (p.Phe432Leu).Through RT-PCR assay，we found thatIRS4 gene was abundantly expressed in hypothalamus and pituitary，but weakly expressed in other tissues.Furthermore，we genotyped the 3 SNPs in White Duroc×Erhualian F2intercross，Sutai pigs，Erhualian pigs and DLY[Duroc×(Landrace×Yorkshire)]three-way crossbred pigs and Chinese local wild boar by PCR-RFLP，then calculated allele frequencies and estimated the associations between those SNPs and backfat thicknesses (BFTs) at shoulder，chest，waist and hip，abdominal fat weight (AFW)，intramuscular fat content (IMF) and loin eye area (LEA) in these populations.The SNP g.96C>G was almost fixed in the F2intercross，so it was first excluded as a causative mutation (QTN) underlying this QTL.For both SNPs g.1794T>C and g.1829T>C，all western breeds (White Duroc and DLY) only had TT genotype，while，in the Erhualian population，the frequencies of CC genotypes at g.1794T>C and g.1829T>C were 65% and 100%，respectively.The results of association analysis showed that g.1794T>C was highly associated with all investigated traits in the F2intercross (P<0.01)，but associated only with IMF in Sutai pigs(P<0.05)and had no significant effect on Erhualian’s phenotypes；g.1829T>C was significantly associated with several fatness traits (e.g.BFT and LEA) in the F2intercross and Sutai pigs.Moreover，bioinformatics analysis demonstrated that the potential influence of the missense variant g.1794T>C on IRS4 protein function was limited.The results suggest that the SNP g.1794T>C is unlikely to be QTN，and the SNP g.1829T>C associated with fat deposition traits across populations could be used as marker for selection of these traits.

pig；IRS4 gene；QTL；polymorphism；differential expression；fat deposition traits

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.002

2014-10-16

國家“973”計劃項目(2012CB124702)；江西省重大科技項目(20114ACB01100)

馬煥班(1990-)，男，江西上饒人，碩士，主要從事豬肉質(zhì)性狀的遺傳解析工作，E-mail：jiangximhb@sina.com

*通信作者：麻駿武，副教授，Tel/Fax：0791-83813080，E-mail：ma_junwu@hotmail.com；郭源梅，副研究員，Tel/Fax：0791-83813080，E-mail：gyuanmei@hotmail.com

S828.2

A

0366-6964(2015)07-1084-11