龐學斌，張 偉，邱穎姮，鄔曉鷗

（深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室/深圳市藥品檢驗所，廣東518057）

高效液相色譜法測定牡蠣大豆肽肉堿口服液中維生素B6含量的不確定度評定

龐學斌，張 偉，邱穎姮，鄔曉鷗

（深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室/深圳市藥品檢驗所，廣東518057）

目的評定高效液相色譜法（HPLC法）測定牡蠣大豆肽肉堿口服液中維生素B6含量的不確定度。方法采用HPLC法測定試樣中維生素B6的含量，根據(jù)建測量模型，確定影響不確定度的分量，并加以評定量化，得出合成不確定度和擴展不確定度。結(jié)果試樣中維生素B6含量測得值為0.498mg/100mL，其中B6含量的相對不確定度為0.024 9，標準不確定度為0.012 4mg/100mL，擴展不確定度為0.024 8mg/100mL（k=2）。結(jié)論建立的計算方法實用、可靠，可以用于HPLC法測定牡蠣大豆肽肉堿口服液中維生素B6含量的不確定度評定，經(jīng)評定發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜儀定量重復(fù)性對不確定度的影響最大。

色譜法，高壓液相； 維生素B6； 牡蠣； 數(shù)學計算

隨著測量技術(shù)的不斷發(fā)展，描述測量準確程度的方法也不斷發(fā)展，過去習慣用誤差、準確度等概念來描述，從1995年開始，國際上正式使用不確定度來表達測量結(jié)果的分散程度[1-3]。測量結(jié)果通常表示為單個測得的量值和一個測量不確定度[4]。維生素B6是海王金樽牌牡蠣大豆肽肉堿口服液中的功效成分之一，能顯著降低H型高血壓患者的血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平[5]。目前對其用高效液相色譜法（HPLC法）進行含量測定的不確定度評定研究鮮有報道[6-7]。本研究依據(jù)相關(guān)資料與文獻[8-10]，采用HPLC法對試樣中維生素B6的含量進行測定，并評估影響不確定度的因素及其各個不確定度分量對測定結(jié)果的影響大小，建立適用于HPLC法測定該樣品中維生素B6含量的不確定度評定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 XS105DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，d＝0.01mg）；Alliance e2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters，配有2998DAD檢測器）；容量瓶及移液管均為A級。

1.1.2 試劑 維生素B6對照品（SUPELCO，含量為99.9%，相對標準差：±0.5%）；乙腈（默克，色譜純）；其余試劑如無特殊說明均為分析純。

1.1.3 樣品 海王金樽牌牡蠣大豆肽肉堿口服液（企業(yè)委托送檢）。

1.2 方法

1.2.1 實驗條件

1.2.1.1 實驗室溫度 （20±5）℃。

1.2.1.2 色譜條件 GL Sciences Inc.Inertsil ODS-3色譜柱（4.6mm×250.0mm，5.0μm）；流動相：1-庚烷磺酸鈉溶液（1.22→850）；乙腈∶磷酸=850∶150∶1；流速：1mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：280 nm。

1.2.2 測定方法 依據(jù)GB/T 5009.197-2003保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定方法，對試樣中維生素B6的含量進行測定。

1.2.2.1 供試品溶液配制 將樣品搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待進樣。

1.2.2.2 對照品溶液配制 精密稱取維生素B6對照品（含量為99.9%）11.40mg，置于10mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為1.139mg/mL對照品儲備溶液；量取1.00mL該儲備溶液至200mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得5.695μg/mL的對照品溶液。

1.2.2.3 測定 分別量取供試品溶液、對照品溶液各10μL注入HPLC儀，記錄色譜圖和峰面積。

1.2.3 不確定度來源分析

1.2.3.1 測量模型 依據(jù)GB/T5009.197-2003保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定方法，根據(jù)本實驗具體情況，試樣經(jīng)濾過后直接進樣，測量模型為：

本研究考慮了測量重復(fù)性引入的不確定度（包括樣品不均勻、容器及儀器和其他因素引入的不確定度統(tǒng)一計算），加入復(fù)現(xiàn)性修正量R，其值視為零，不確定度非零。加入后模型式（1）變?yōu)槟Ｐ褪剑?）：

模型式（2）、（3）中：X為每100毫升試樣中維生素B6的含量（mg）；R為重復(fù)測量修正量；AT為供試品溶液的峰面積；CR為對照品溶液的濃度，μg/mL；100為mg/mL轉(zhuǎn)換為mg/100mL的系數(shù)；1 000為μg轉(zhuǎn)換為mg的系數(shù)；AR為對照品溶液的峰面積；0.1為100除以1 000的得數(shù)。

因此，根據(jù)模型（3），共3個輸入量：AT、CR與AR，并考慮重復(fù)性，用因果圖分析不確定來源，見圖1、2所示。

圖1 考慮測量重復(fù)性后的含量不確定度來源因果圖

圖2 含量不確定度來源因果圖

1.2.3.2 合成不確定度表達式 模型式（2）是線性模型，合成標準不確定度表達式為：

其中uc（X′）為考慮測量重復(fù)性后含量的合成標準不確定度；u2（X）為測得值的方差；u2（R）為重復(fù)測量值的方差。

由于測量模型式（3）屬于各輸入量相乘的函數(shù)關(guān)系，依據(jù)JJF 1059.1-2012，試樣中維生素B6的含量相對標準不確定度為：

其中：urel（X）為試樣中維生素B6含量的相對標準不確定度；u2rel（AT）為供試品溶液峰面積的相對不確定度；u2rel（CR）為對照品溶液濃度的相對不確定度；u2rel（AR）為對照品溶液峰面積的相對不確定度。

2 結(jié) 果

2.1 不確定度評定 根據(jù)模型式（5），試樣中維生素B6含量的相對標準不確定度由AT、CR和AR3個分量引入，結(jié)果評定如下。

2.1.1 供試品峰面積的相對標準urel（AT） 供試品峰面積的不確定度主要由HPLC儀進樣的重復(fù)性引起[10]，查詢儀器檢定證書，其定量重復(fù)性相對標準偏差為3.0%，按矩形分布計算，供試品峰面積的相對標準為：

2.1.2 對照品溶液濃度的相對標準不確定度urel（CR）對照品溶液濃度的不確定度主要由天平、維生素B6對照品純度、10mL容量瓶、移液管、200mL容量瓶等5個分量引入，以下為經(jīng)分別計算的各自相對標準不確定度。

2.1.2.1 天平引入的相對不確定度u1rel（CR） 使用天平稱取維生素B6對照品引入的不確定度來源有：（1）天平最大允許誤差引入的不確定度評定，根據(jù)天平計量證書，在10mg量程的最大允許誤差為0.05mg，按正態(tài)分布計算，其標準不確定度為：0.05/3=0.016 67mg。（2）分辨力導(dǎo)致的不確定度評定，根據(jù)天平計量證書，其分辨力為0.01mg，按矩形分布計算，其標準不確定度為：0.01/=0.005 78mg。（3）天平重復(fù)性導(dǎo)致的不確定度評定，由于本次實驗做了10次獨立重復(fù)實驗，由天平重復(fù)性導(dǎo)致的不確定度忽略，故不加入天平不確定度的合成。所以天平導(dǎo)致的合成相對標準不確定度為：

2.1.2.2 維生素B6對照品純度引入的相對不確定度u2rel（CR） 本次購買的SUPELCO公司的維生素B6對照品，其標準物質(zhì)證書中標示含量為99.9%，相對標準偏差為0.5%，按矩形分布，維生素B6對照品純度引入的相對不確定度為u2rel（CR）=0.005/3=2.89×10-3。

2.1.2.3 對照品定容至10mL容量瓶引入的相對標準不確定度u3rel（CR） 對照品定容至10mL容量瓶，得到維生素B6對照品儲備液，其不確定度主要由允差、溫度和重復(fù)性3個分量引入。（1）容量瓶允差：本次實驗使用的10mL容量瓶為A級，允差為±0.020mL[11]，按三角分布，取包含因子k=，則其相對標準不確定度為：0.020//10=8.16×10-4。（2）溫度引入的不確定度：由于實驗室溫度與玻璃儀器校準時溫度不同引起體積差異而引入的不確定度為B類不確定度。純水的體積膨脹系數(shù)（2.1×10-4/℃）比玻璃的體積膨脹系數(shù)（2.5×10-5/℃）明顯要大[11]，故忽略后者。實驗室溫度在（20±5）℃，按矩形分布，取包含因子k=，則其相對標準不確定度為：5× 2.1×10-4×10//10=6.06×10-4。（3）重復(fù)性引入的不確定度：同天平重復(fù)引入的不確定度原因，本次不計入容量瓶不確定度評定。

由上可得對照品定容至10mL容量瓶引入的相對標準不確定度為：

2.1.2.4 1 mL移液管引入的相對標準不確定度u4rel（CR） 用1mL移液管（A級）量取維生素B6對照品儲備液1mL，其不確定度主要由移液管允差、溫度和重復(fù)性3個分量引入。計算過程與10mL容量瓶類似。（1）移液管允差：1mL移液管（A級）允差為±0.007mL[6]，其相對標準不確定度為：0.007//1=2.86×10-3。（2）溫度：相對標準不確定度為：5×2.1×10-4×1//1=6.06×10-4。（3）重復(fù)性：不計入。

由上可得1mL移液管引入的相對標準不確定度為：

2.1.2.5 200mL容量瓶引入的相對標準不確定度u5rel（CR） 對照品儲備液稀釋并定容至200mL容量瓶，其不確定度來源與10mL容量瓶相同，計算過程與10mL容量瓶類似。（1）容量瓶允差：200mL容量瓶（A級）允差±0.15mL[11]，其相對不確定度為0.15//200=3.06× 10-4。（2）溫度：相對標準不確定度為 5×2.1×10-4×200//200=6.06×10-4。（3）重復(fù)性：不計入。

由上可得200mL容量瓶引入的相對標準不確定度為：

所以，對照品溶液濃度（CR）的相對方差為：

所以，對照品溶液濃度（CR）的相對不確定度urel（CR）為4.55×10-3。

2.1.3 對照品峰面積的相對標準不確定度urel（AR） 與樣品峰面積的相對標準不確定度相同，對照品峰面積的相對標準不確定度為：

綜上所述，合并X、AT與AR3個分量相對標準不確定，得到試樣中維生素B6含量的相對不確定度：

2.2 合成標準不確定度

2.2.1 試樣中維生素B6含量的標準不確定度 測得3次對照品溶液峰面積分別為91 351、94 319、94 966μv/s，平均值為 93 545μv/s；3次樣品溶液峰面積分別為82 014、81 809、81 628，平均值為81 817μv/s；對照品溶液溶度CR為5.695μg/mL，根據(jù)模型式（3），計算得到試樣中維生素 B6的含量為每 100毫升 0.498 mg。

所以，試樣中維生素B6含量的標準不確定度u（X）=urel（X）×X=0.024 9×0.498=0.012 4mg/100mL。

2.2.2 重復(fù)測量性引入的不確定度 人工操作和儀器讀數(shù)都會帶來重復(fù)性問題。與每一次測量結(jié)果直接相關(guān)的重復(fù)測量過程包括天平稱量、容量瓶定容、移液管移液。為避免重復(fù)引入和計算方便，將天平稱量操作的重復(fù)性、定容體積重復(fù)性、移液體積重復(fù)性這幾項重復(fù)性分量合并為總測量過程的一個分量，由測量結(jié)果的重復(fù)性表示。

抽取同一批樣品10份，按照同樣測量程序進行平行測量，測量結(jié)果列于表1。

由貝塞爾公式，測得值X的標準偏差為：

所以測量重復(fù)性引入的標準不確定度為：

表1 試樣中維生素B6的測量結(jié)果

相對標準不確定度為：

綜上所述，由模型式（4）得：

所以考慮重復(fù)性后的標準不確定度u（X′）=urel（X′）× X=0.024 9×0.498=0.012 4mg/100mL，取包含因子k=2，則擴展不確定度u（X）=0.024 8mg/100mL，所以擴展相對不確定度為urel（X）=0.024 8/0.498×100=4.98%。該口服液中維生素B6的含量測量結(jié)果為X=（0.498±0.024 8）mg/100mL，k=2。各不確定度分量及值見表2。

表2 各不確定度來源、符號及值情況

3 討 論

3.1 本研究結(jié)果顯示，供試品峰面積和對照品峰面積即高效液相色譜儀定量重復(fù)性引入的不確定度對實驗中維生素B6含量測定的不確定度影響貢獻最大，在實驗中可選擇定量重復(fù)性狀態(tài)更佳的儀器，達到降低不確定度的效果。

3.2 除供試品峰面積和對照品峰面積外，其余分量對合成不確定度的影響貢獻較小，并且使用較大容量的容量瓶或移液管進行操作可降低不確定度值。

[1]謝瓊玉.HPLC法測定賴諾普利片含量及含量均勻度的不確定度評定[J].中國藥房，2013，24（40）：3827-3830.

[2]劉亞妮，馬林，劉金梅，等.高效液相色譜法測定人血漿中頭孢替坦二鈉含量的不確定度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2013，33（20）：1695-1698.

[3]苗愛東，王彥宗.高效液相色譜法測定甲硝唑片中甲硝唑含量的不確定度分析[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2012，24（1）：33-35.

[4]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S].北京：中國標準出版社，2013.

[5]晏彪，鄭良榮，陳振云.葉酸、維生素B6對H型高血壓高同型半胱氨酸血癥的療效觀察[J].心腦血管病防治，2013，13（2）：126-127.

[6]金鵬飛，夏路風，李錚，等.高效液相色譜同時測定多維元素片中的維生素B1、維生素B6、維生素C、煙酰胺和泛酸[J].藥物分析雜志，2012，32（9）：1606-1610.

[7]王發(fā)，郭歡迎，唐娜，等.HPLC法測定復(fù)方醋酸棉酚片中維生素B1和B6的含量[J].安徽醫(yī)藥，2013，17（4）：565-566.

[8]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF 1135-2005化學分析測量不確定度評定[S].北京：中國計量出版社，2005.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.197 -2003保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定[S].北京：中國標準出版社，2004.

[10]倪曉麗.化學分析測量不確定度評定指南[M].北京：中國計量出版社，2008：96.

[11]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJG196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2007.

Uncertainty evaluation of determ ination of vitam in B6content in oyster soybean peptide carnitine oral liquid by high performance liquid chromatography

Pang Xuebin，ZhangWei，Qiu Yingyuan，Wu Xiaoou
（Shenzhen Quality Standard Research Key Laboratory/Shenzhen DrugsControl Institute，Guangdong 518057，China）

ObjectiveUncertainty evaluation ofdetermination ofvitamin B6 contentin oystersoybean peptide carnitine oral liquid byhigh performance liquid chromatography（HPLCassay）.MethodsHPLCwasadopted for thedetermination ofvitamin B6content.Mathematical modelwas established for the evaluation ofuncertainty to quantize influential factors ofuncertainty and evaluate the uncertainty factors further.ResultsThe contentofvitamin B6in sample oral liquid was0.498mg/100mL，in which，the relative uncertaintyofvitamin B6contentwas0.024 9，the standard uncertaintywas0.0124mg/100mL，theexpanded uncertainty was0.0248mg/100mL（k=2）.ConclusionThe calculationmethod ispracticaland reliable，being access to the uncertainty evaluation of content of vitamin B6in oyster soybean peptide carnitine oral liquid by high performance liquid chromatography.Upon the evaluation，itis found that thequantitative repetitive of the HPLC is themajor impact.

Chromatography，high pressure liquid； Vitamin B6； Oysters； Mathematicalcomputing

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.009

：A

：1009-5519（2015）07-0982-04

2014-09-03

2014-11-07）

龐學斌（1979-），男，廣東湛江人，主管藥師，主要從事保健食品、化妝品、藥品質(zhì)量標準的研究；E-mail：pangxueb@sina.com。