董 璐， 代增英， 韓 晴， 李迎秋

(齊魯工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，濟南 250353)

茶多酚對大腸桿菌抑菌機理的研究

董 璐， 代增英， 韓 晴， 李迎秋

(齊魯工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，濟南 250353)

茶多酚(tea polyphenols, TP)是一種具有廣譜抗菌作用的活性質(zhì)，以大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)為研究對象，采用牛津杯實驗研究茶多酚的最小抑菌濃度，并采用結(jié)晶紫實驗、電導(dǎo)率測定、離子泄漏測定來分析TP對E.coli細(xì)胞膜通透性的影響。通過瓊脂糖凝膠電泳分析TP對E.coliDNA的影響。結(jié)果顯示，TP對E.coli的最小抑菌濃度為40 μg /mL；結(jié)晶紫實驗中，隨著濃度的增大，OD590也隨之增大；隨著處理時間的增長，電導(dǎo)率隨之增大，離子泄漏隨之增多，說明TP可以作用于E.coli的細(xì)胞膜，能夠改變其通透性。通過瓊脂糖凝膠電泳分析可知TP處理后和空白對照組相比較，DNA條帶出現(xiàn)變暗、拖尾現(xiàn)象，說明TP能夠作用于E.coli的遺傳物質(zhì)DNA。

茶多酚;抑菌活性;抑菌機理;大腸桿菌

綠茶是世界上最受歡迎的飲品之一，由于其中富含許多營養(yǎng)物質(zhì)，如茶多酚(tea polyphenols，TP)、維生素和氨基酸等物質(zhì)[1]，并且TP具有抑菌、抗氧化、抗癌和抗齲齒等生理功能[2-5]，同時還具有減肥降血脂的功效[6]。中國已經(jīng)明確把TP作為食品抗氧化劑列入到《GB2760-2011食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，對TP的抗氧化能力的研究已經(jīng)十分成熟。近年來，對TP抑菌活性的研究也日趨成熟。TP具有廣譜抗菌作用，它對病毒[7]、腸道致病菌[8]、口腔微生物[9-11]和孢子[1]均有不同程度的抑制作用。TP占茶葉干重達(dá)15%[12]，主要由兒茶酸(catechin, C)，表兒茶素(epicatechin, EC)，沒食子兒茶素(gallocatechin, GC)，表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)，表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)組成[13]，其中EGCG和ECG是TP中兩種主要成分，含量分別為36%和24%，同時也是使TP具有抑菌作用的主要成分[14]。Yanagawa 等人研究EGCG對臨床分離的對抗生素有抗性的幽門螺旋菌的抑菌活性，結(jié)果顯示MIC90為100 μg/mL[13]。Cho等人研究茶多酚對抗藥性金黃色葡萄球菌(MSRA)作用結(jié)果為，TP對13株MSRA的MIC為8～512 μg/mL，而當(dāng)采用Oxacillin與≤0.5倍MIC復(fù)配時，Oxacillin的MIC 降低8～128倍[15]。Gordon 等人研究了EGCG對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的抑菌效果，當(dāng)EGCG濃度為256 μg/mL 時，可殺死50%的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌[16]。目前，已有研究者將其應(yīng)用于水果、海鮮及肉制品的防腐保鮮方面[17-19]。但是對TP的抑菌機理還不清楚，有研究報道TP可作用于細(xì)菌微生物的磷脂雙分子層[20]。本文實驗通過結(jié)晶紫實驗，電導(dǎo)率測定，離子泄漏實驗研究TP對E.coli細(xì)胞膜通透性的影響，并研究TP對DNA的作用情況。

1 材料與方法

1.1 材料

茶多酚(≥98%)湖南金農(nóng)生物股份有限公司；供試菌種(E.coli)由作者實驗室保藏；菌種用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；MApADA V-1100可見光分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；京立/LG10-2.4A型高速離心機，北京京立離心機有限公司； 雷磁電導(dǎo)率儀ODS-307，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

將E.coli活化后，接種于LB液體培養(yǎng)基，37 °C搖床培養(yǎng)過夜，使其活菌數(shù)達(dá)約108cfu/mL備用。

供試藥劑：200 g/L草銨膦水劑，購自永農(nóng)生物科學(xué)有限公司；農(nóng)博士低容量施藥專用助劑，購自廣西田園生化股份有限公司。

1.3.2 最小抑菌濃度(MIC)測定

采用牛津杯法，用無菌移液器取上述各種菌懸液0.5 mL于平板上，然后用無菌涂布棒涂布均勻，待凝固后將直徑為9 mm、已殺菌的牛津杯呈正三角形放置在每個平板上。采用二倍稀釋法將TP配成質(zhì)量濃度為10、20、40、80、160、320和640 μg/mL的水溶液。每個平板其中2個牛津杯內(nèi)加入TP溶液，另一個加入無菌水作為空白對照。每個濃度TP重復(fù)3個平板，于37℃培養(yǎng)24 h，用透明直尺測量抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑≥10 mm時認(rèn)為有抑菌作用。

1.3.3 結(jié)晶紫試驗

供試菌E.coli在37 °C下于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液濃度約為108cfu/mL。取3 mL菌液4500 r/min離心15 min，得菌體，用蒸餾水沖洗3次后重懸于3 mL含有不同濃度TP(40、80、160、320和640 μg /mL)的PBS緩沖液(0.05 M，pH值7.0)中，置于37℃下培養(yǎng)30 min。培養(yǎng)結(jié)束后8000 r/min離心5 min，得菌體重懸于含有10 μg/mL結(jié)晶紫的PBS緩沖液(pH值7.0)中37 °C下培養(yǎng)10 min，之后12000 r/min下離心15 min，收集上清液在OD590處使用紫外可見分光光度計測量吸光度(用0 μg/mL TP處理的作為對照組調(diào)零)。

1.3.4 電導(dǎo)率測定

通過測定TP與E.coli作用后電導(dǎo)率的變化研究TP對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響。將待測E.coli在37℃下于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其菌落濃度約為108cfu/mL，取此菌懸液在轉(zhuǎn)速為6000 r/min條件下離心15 min。將得到的菌體重懸于磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)緩緩的洗劑3次。加入不同濃度(40、80和160 μg/mL)相同體積的TP的液體，用無菌水代替TP作為對照組。然后放在37 °C的搖床振蕩(150 r/min)培養(yǎng)，每隔20 min取出5 mL，在6000 r/min下離心5 min，用電導(dǎo)率儀分別測定菌液在0、20、40、60、80、100和120 min的電導(dǎo)率值。

1.3.5 離子泄漏的測定

將培養(yǎng)至菌液濃度約108cfu/mL的E.coli菌懸液離心，用無菌水洗滌3次，實驗組加入TP至終濃度為4倍的MIC，以加入相同體積的無菌水作為對照組，在37℃、150 r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，每隔20 min取出5 mL菌液，在6000 r/min下離心5 min，取上清液進(jìn)行消化處理，然后用原子吸收光譜儀分別檢測上清液中K+、Ca2+和Mg2+的濃度變化，并繪制曲線。

分別將培養(yǎng)至對數(shù)期E.coli在3000 r/min下離心15 min，收集沉淀進(jìn)行分組實驗。對照組A：取10 mgE.coli菌體懸浮于 PBS 緩沖液，37 °C保溫 6 h后，提取DNA；實驗組B1：取10 mgE.coli菌體沉淀物懸浮于80 μg/mL TP溶液，37 °C保溫6 h后提取DNA；實驗組B2：取10 mgE.coli菌體沉淀物懸浮于160 μg/mL TP溶液，37 °C保溫6 h后提取DNA。DNA的提取按試劑盒提取步驟進(jìn)行。根據(jù)DNA的分離范圍選擇1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行恒壓70 V電泳，電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 TP對E.coli的最小抑菌濃度(MIC)

表1 TP對E. coli 的抑菌圈直徑

由表1可知，隨著TP濃度的增大，抑菌圈直徑也隨之增大；當(dāng)TP濃度為40 μg/mL時，抑菌圈直徑為(11±0.2) mm，此濃度即為TP的MIC。說明TP 對E.coli具有良好的抑菌活性。

2.2 結(jié)晶紫試驗結(jié)果分析

通過測定E.coli對結(jié)晶紫的吸收，測定TP對E.coli細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響。如圖1所示：隨著TP濃度的增加，OD590值逐漸增大；當(dāng)TP的濃度為0～160 μg/mL的時候，OD590值從0增加到0.377，變化顯著；當(dāng)TP的濃度大于160 μg/mL的時候，OD590值從0.377增加到0.3835，可見變化不明顯。結(jié)果表明TP 能夠改變E.coli細(xì)胞膜的通透性，并且在TP濃度為160 μg/mL 時，作用效果最佳。

圖1 不同TP濃度處理E. coli OD590的變化

2.3 電導(dǎo)率的變化

通過測定E.coli電導(dǎo)率的變化，研究TP對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響，電導(dǎo)率增加說明菌液的導(dǎo)電性增加，細(xì)胞內(nèi)有帶電離子等溶出，進(jìn)而得出細(xì)胞膜的通透性增加。如果加入TP作用后，電導(dǎo)率發(fā)生變化說明了TP對細(xì)胞膜的通透性有影響。

◆—空白對照組；■—40 μɡ/mL TP；▲—80 μɡ/mL TP；●—160 μɡ/mL TP。

如圖2所示，加入TP處理E.coli后電導(dǎo)率的變化趨勢為：空白對照組隨著時間的增加，電導(dǎo)率基本上沒有變化；用TP處理的E.coli的電導(dǎo)率隨著時間的增加逐漸升高；在相同的時間，隨著TP濃度的增加，各組的電導(dǎo)率逐漸增加；用40 μg/mL TP 處理的E.coli的電導(dǎo)率與空白對照組相比變化較小，用80 μg/mL和160 μg/mL TP 處理的E.coli的電導(dǎo)率與空白對照組相比變化顯著。由此可見，TP對E.coli細(xì)胞膜的通透性有影響，隨著TP濃度的增大，TP對膜的通透性的影響效果有增加的趨勢；在相同濃度條件下，隨著時間的增加，TP對細(xì)胞膜通透性的影響也增加。

2.4 離子泄露的結(jié)果分析

用原子吸收光譜儀分別檢測上清液中K+的實驗結(jié)果如圖3所示：隨著處理時間的增加，空白對照組上清液中K+的濃度變化不大，呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢，然而經(jīng)過4倍MIC濃度的TP處理的E.coli的上清液中K+的濃度變化比較明顯，處理30 min后變成17.02 μg/mL(此時空白對照組的值為4.68 μg/mL)。說明TP處理后能夠引起E.coli內(nèi)K+的泄露。

圖3 不同處理時間K+的泄露程度

圖4 不同處理時間Ca2+的泄露程度

圖4為用原子吸收光譜儀分別檢測的上清液中Ca2+濃度實驗結(jié)果，可見用無菌純凈水處理的對照組的Ca2+濃度隨著時間的增加基本上保持不變，在相同的時間段，用TP處理的菌體上清液中的Ca2+濃度比空白明顯要大。用4倍MIC濃度的TP處理的Ca2+濃度在30 min時達(dá)到9.23 μg/mL(空白對照組為3.58 μg/mL)，在60 min時為12.03 μg/mL(空白為4.32 μg/mL)。60 min以后隨著TP作用時間的增加，上清液中Ca2+濃度基本上保持不變，說明可能此時細(xì)菌細(xì)胞膜的鈣離子通道已經(jīng)被破壞了，不再起作用，從而Ca2+濃度基本上達(dá)到平衡。

圖5 不同處理時間Mg2+的泄露程度

用原子吸收光譜儀分別檢測上清液中Mg2+的實驗結(jié)果如圖5所示：在30 min時，TP處理組的上清液的Mg2+濃度為1.53 μg/mL，空白對照組為1.036 μg/mL；60 min時，TP處理組的上清液的Mg2+濃度為2.32 μg/mL，而空白對照組為1.17 μg/mL；90 min時，TP處理后Mg2+濃度為2.76 μg/mL，而空白對照組為1.197 μg/mL?？梢娫谙嗤奶幚頃r間TP處理的E.coli上清液中的Mg2+濃度比空白對照組大，且隨著時間的增加空白對照組的上清液中Mg2+濃度基本上保持不變，隨著時間的增加TP處理的E.coli上清液中的Mg2+濃度逐漸增大。

由圖3、4、5可知TP能夠引起細(xì)胞內(nèi)K+、Ca2+和Mg2+的泄露，證明了TP能夠作用于E.coli的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的通透性增加。

2.5 TP對細(xì)菌DNA的影響

圖6 TP處理E. coli DNA的影響

對照組A—PBS 緩沖液；實驗組B1—80 μg/mL TP溶液；實驗組B2—160 μg/mL TP溶液。

用配制不同濃度的TP 處理E.coli6 h，然后利用試劑盒提取E.coli的DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6。與空白對照組A相比，實驗組B1和實驗組B2變化比較明顯，實驗組B2與空白對照組A相比條帶亮度變淺，并且實驗組B2的條帶出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象。結(jié)果證明，TP能夠作用于E.coli的DNA。

3 結(jié)論

本文研究了TP對E.coli最小抑菌濃度，以及對細(xì)胞膜和DNA的作用。結(jié)果表明：TP對E.coli的MIC為40 μg/mL。通過測定結(jié)晶紫的吸收、電導(dǎo)率的變化、離子的泄露說明TP可以作用于E.coli的細(xì)胞膜，能夠改變其通透性，能使細(xì)胞外的小分子容易進(jìn)入以及引起細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)泄漏；TP與E.coli作用后提取其DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳可觀察到處理后菌體的DNA條帶變暗甚至拖尾，說明TP能夠作用于E.coli的遺傳物質(zhì)DNA。

[1]Hara-Kudo Y, Yamasaki A, Sasaki M, et al. Antibacterial action on pathogenic bacterial spore by green tea catechins[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85(14): 2354-2361.

[2]Hirasawa M, Takada K, Otake S. Inhibition of acid production in dental plaque bacteria by green tea catechins[J]. Caries Research, 2006, 40(3): 265-270.

[3]Yang C S, Hong J, Hou Z, et al. Green tea polyphenols: antioxidative and prooxidative effects[J]. The Journal of Nutrition, 2004, 134(11): 3181S-3181S.

[4]Yang C S, Jin H, Guan F, et al. Cancer precentive activities of tea polyphenols[J]. Journal of Food and Drug Analysis, 2012, 20(1): 318-322.

[5]Cho Y S, Oh J J. Antimicrobial activity and biofilm formation inhibition of green tea polyphenols on human teeth[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2010, 15: 359-364.

[6]Yang D J, Chang Y Y, Hsu C L, et al. Antiobesity and hypolipidemic effects of polyphenol-rich longan (DimocarpuslongansLour.)flower water extract in hypercaloric-dietar rats[J]. Journal of Agriculture and Chemistry, 2010, 58: 2020-2027.

[7]Nakayama M, Suzuki K, Toda M, et al. Inhibition of the infectivity of influenza virus by tea polyphenols[J]. Antiviral Research, 1993, 21(4): 289-299.

[8]Okubo T, Ishihara N, Oura A, et al. In vivo effects of tea polyphenol intake on human intestinal microflora and metabolism[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1992, 56(4): 588-591.

[9]Sakanaka S, Kim M, Taniguchi M, et al. Antibacterial substances in Japanese green tea extract againstStreptococcusmutans, a cariogenic bacterium[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1989, 53(9): 2307-2311.

[10]Sakanaka S, Aizawa M, Kim M et al. Inhibitory effects of green tea polyphenols on growth and cellular adherence of an oral bacterium,Porphyromonasgingivalis[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1996, 60:745 749.

[11]Sakanaka S, Sato T, Kim Met al. Inhibitory effects of green tea polyphenols on glucan synthesis and cellular adherence of cariogenic streptococci[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1990, 54:2925-2929.

[12]Hara Y. Antioxidants in tea and their physiological functions[M]. Springer: Food and Free Radicals, 1997: 49-65.

[13]Yanagawa Y, Yamamoto Y, Hara Y, et al. A combination effect of epigallocatechin gallate, a major compound of green tea catechins, with antibiotics onHelicobacterpylorigrowth in vitro[J]. Current Microbiology, 2003, 47(3): 0244-0249.

[14]Van Het Hof K H, Wiseman S A, Yang C S, et al. Plasma and lipoprotein levels of tea catechins following repeated tea consumption[J]. Experimental Biology and Medicine, 1999, 220(4): 203-209.

[15]Zhao W H, Hu Z Q, Okubo S, et al. Mechanism of synergy between epigallocatechin gallate and β-lactams against methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, 45(6): 1737-1742.

[16]Gordon N C, Wareham D W. Antimicrobial activity of the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) against clinical isolates ofStenotrophomonasmaltophilia[J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 2010, 36: 129-131.

[17]王玉婷, 邵秀芝, 冀國強. 大黃魚冷藏過程中品質(zhì)變化及腐敗菌的分析及抑菌研究[J]. 肉類研究, 2010 (11): 11-15.

[18]劉開華, 豆成林. 涂膜保鮮劑中添加茶多酚對草莓貯藏品質(zhì)的影響[J]. 中國食品添加劑, 2011 (4): 75-78.

[19]劉書亮, 夏靜華, 葉勁松, 等. 三種天然保鮮劑對肉中腐敗菌和致病菌的抑制效果[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010 (3): 46-50.

[20]Ikigai H, Nakae T, Hara Y, et al. Bactericidal catechins damage the lipid bilayer[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1993, 1147(1): 132-136.

Research on the antibacterial mechanism of tea polyphenols onEscherichiacoli

DONG Lu, DAI Zeng-ying, HAN Qing, LI Ying-qiu

(College of Food and Biological Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353, China)

Tea polyphenols is an active material with broad-spectrum antibacterial action. In this paper, Oxford cup experiment was performed to study the minimal inhibitory concentration of TP onE.coli. Crystal violet assay, electrical conductivity test and ion leakage measurement were also performed to determine the effect of TP on cell membrane ofE.coli. Agarose gel electrophoresis was carried out to analyze the effect of TP onE.coliDNA. The results was the minimal inhibitory concentration of TP was 40 μg/mL. The value ofOD590increased with the increase of TP concentration. And the value of conductivity and ion leakage increased with the increase of time, which shown that TP could change cell membrane permeability. DNA ofE.colitreated with TP was extracted and compared with blank control group, the band of DNA of experiment group emerged dimmed and trailing, and this result indicated that TP can act on DNA ofE.coli.

tea polyphenols; antibacterial activity; antibacterial mechanism;Escherichiacoli

2014-08-05；

2014-09-01

董 璐，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)；

李迎秋，博士，教授，研究方向為食品生物技術(shù)，E-mail:donglu1006@163.com。

TS201.3

A

2095-1736(2015)01-0072-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.072