舒歡歡， 鄭偉賢， 錢云霞

(寧波大學 海洋學院 應用海洋生物技術教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

鱸魚ZnT基因的cDNA克隆及生物信息學分析

舒歡歡， 鄭偉賢， 錢云霞

(寧波大學 海洋學院 應用海洋生物技術教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

鋅轉運蛋白(zinc transporters, ZnT)在細胞鋅的儲藏，釋放和分布中起了重要的作用。運用RT-PCR和SMART RACE方法從鱸魚肝臟克隆得到了鱸魚ZnT基因全長cDNA序列。結果顯示，鱸魚ZnT全長為1747 bp，包括5′非翻譯區(qū)84 bp，3′非翻譯區(qū)490 bp，開放閱讀框1173 bp，可編碼390個氨基酸。生物信息學分析表明該蛋白有6次跨膜結構，N端和C端均位于細胞膜內側，第IV和第V跨膜區(qū)之間的環(huán)富含組氨酸。鱸魚ZnT的氨基酸序列與其他生物的ZnT7序列有高度的相似性：斑馬魚，85.6%；大西洋鮭，85.4%；紅鰭東方鲀，84.3%；人，75.1%；小鼠，73.8%。聚類分析顯示鱸魚ZnT首先與其它魚類和人ZnT7成一簇，再與魚的其他類別ZnT聚合，說明分離到的鱸魚ZnT為ZnT7。

鱸魚; ZnT; 克隆

鋅是生物體必需微量元素，參與了細胞內許多不同的代謝過程。首先，鋅作為多種酶的輔助因子參與機體的生理生化反應；其次，鋅通過鋅指機構域而調節(jié)DNA復制，RNA轉錄以及基因的表達等作用；另外，鋅還可以作為功能成分穩(wěn)定跨膜蛋白的結構等，因此細胞內鋅的穩(wěn)定和平衡對機體非常關鍵[1-3]。鋅在細胞的平衡主要由細胞膜和細胞器中兩大類鋅轉運蛋白(zinc transporters)的活力決定。一類是Slc30(solute-linked carrier 30)基因編碼的鋅轉運蛋白家族(zinc transporter family, ZnT)，也叫陽離子擴助蛋白 (cation diffusion facilitator, CDF)家族；另一類是SLC39(solute-linked carrier 39)基因編碼的ZRT/IRT類似蛋白(ZRT/IRT-like protein，ZIP)家族[2-3]。ZnT的作用是通過將鋅從胞內運送到胞外空間或運入至細胞器從而降低胞內鋅的含量，而ZIP家族的作用則相反，當胞漿內鋅含量低時將鋅從細胞器運入胞內而提高胞內鋅含量[2-3]。迄今在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)10個ZnT家族成員(ZnT 1～10)和14個ZIP家族成員(ZIP 1～14) 。

鋅元素是魚類重要的營養(yǎng)元素，但是過量的鋅元素對魚類有毒性，尤其在水環(huán)境中[4]。作為吸收和轉運鋅元素的關鍵蛋白，ZnT在魚類的研究中鮮有報道，在NCBI數(shù)據(jù)庫，我們僅發(fā)現(xiàn)有斑馬魚(Daniorerio)、大西洋鮭(Salmosalar)和紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)等少量基因序列，而文獻只見關于斑馬魚鋅轉運蛋白在發(fā)育中作用的報道[5-6]。鱸魚(Lateolabraxjaponicus)俗稱白花鱸，青鱸，七星鱸魚，是浙江省海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種。我們用SMART RACE方法從鱸魚肝臟中克隆ZnT基因的全長cDNA序列，并對其結構進行了生物信息學分析，為今后研究ZnT在魚類鋅元素的轉運和代謝中的作用和機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

實驗對象： 實驗所用的鱸魚取自寧波象山港黃避岙某養(yǎng)殖場。

實驗試劑： 常規(guī)PCR所需試劑和pMD18-T均為TaKaRa公司生產(chǎn)；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit為Clontech公司產(chǎn)品；RNAiso Plus試劑，質粒小量抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒由碧云天生物技術有限公司生產(chǎn)；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。大腸桿菌 (Escherichiacoli) DH5α菌株由本實驗室保存。實驗所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 鱸魚ZnT基因的克隆

根據(jù)已知的斑馬魚、紅鰭東方鲀及大西洋鮭的ZnT保守序列，設計兼并引物ZnT-F和ZnT-R用于克隆鱸魚ZnT基因的保守區(qū)(序列見表1)。PCR反應體系50 μL：25 μL Premix Taq，10 μmol/L上下游引物ZnT-F和ZnT-R各2 μL，2 μL模板DNA，用ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件為：94℃預變性4 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳后，將目的條帶切膠回收、連接T-載體、轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，挑選陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

根據(jù)得到的ZnT核心片段的cDNA序列，分別設計3′-RACE和5′-RACE基因巢式引物(見表1)。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書，用鱸魚肝臟總RNA分別合成3′Ready和5′Ready cDNA，分別進行3′-RACE和5′-RACE擴增，PCR產(chǎn)物進行克隆測序，具體同上。

1.3 鱸魚ZnT的結構分析

BioEdit軟件進行氨基酸序列推導及同源性分析。在線http://www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM/對ZnT蛋白跨膜區(qū)域進行預測。蛋白序列的保守結構域由在線軟件InterProScan分析http://www.ebi.ac.uk/interpro/ (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)?？缒さ鞍?D拓撲學結構用TOPO2 (http://www.sacs.ucsf.edu/cgi-bin/open-topo2.py)軟件分析 (Johns 2010)。使用MEGA6.05軟件，通過臨位相連法(Neihbor Joining, NJ)對鱸魚ZnT和GenBank中已收錄的其它已知動物的ZnT氨基酸序列進行分子進化樹聚類分析。

表1 鱸魚ZnT基因克隆及PCR引物

2 結果與分析

2.1 鱸魚ZnT基因的序列及功能位點分析

利用兼并引物ZnT-F和ZnT-R從鱸魚肝臟cDNA中擴增得到一目的片段，克隆測序片段大小為740 bp，經(jīng)過BLAST比對分析確認為鱸魚ZnT的核心序列(圖1)。據(jù)此序列設計巢式RACE PCR引物，分別克隆得到1081 bp的3′RACE產(chǎn)物和236 bp的5′RACE產(chǎn)物(圖1)。將所測得的序列片段用DNAstar軟件進行拼接，最終得到鱸魚ZnT基因cDNA全長序列1747 bp。該序列5′非翻譯區(qū)為84 bp，3′非翻譯區(qū)490 bp，開放閱讀框1173 bp，可編碼390個氨基酸，典型加尾信號AATAAA位于1701～1706 bp處(圖2)。

在線軟件http://ca.expasy.org/tools/分析鱸魚ZnT蛋白序列得到其分子量為43.12 kDa，等電點為6.36。用跨膜蛋白分析軟件TMHMM Server v. 2.0對ZnT氨基酸序列分析表明，鱸魚ZnT蛋白N端和C端均位于胞內，之間存在6個跨膜區(qū)(I ～VI)，每個跨膜區(qū)的氨基酸位置和數(shù)目見圖2。其中第IV和第V跨膜區(qū)之間的環(huán)富含組氨酸，共有26個，大多組氨酸是以 (HX)3形式存在(圖2)。

NetNGlyc 1.0 Server 分析表明鱸魚ZnT蛋白有3個潛在的糖基化位點N-45、N-59、N-181。Interproscan軟件分析結果顯示，鱸魚ZnT蛋白有2個陽離子跨膜轉運蛋白活性結構域(cation transmembrane transporter activity)，分別位于35-167、245-308 。圖3顯示的是用TOPO2 軟件分析的ZnT蛋白的2D拓撲學結構 。

A—ZnT核心片段PCR； B—ZnT 3′RACE擴增； C—ZnT 5′RACE擴增； M—DNA Marker-DL2000。

圖2 鱸魚ZnT全長cDNA序列及其編碼的氨基酸

下劃線表示跨膜區(qū)域；星號為終止密碼子；方框指加尾信號。

2.2 鱸魚ZnT基因系統(tǒng)發(fā)育分析和同源性比較

用軟件MEGA 6.05中的臨位相聯(lián)法(Neighbor-joining，NJ)構建人和幾種魚ZnT1-10的系統(tǒng)進化樹(bootstrap 1000 replicates)。結果表明(圖4)，鱸魚ZnT首先與紅鰭東方鲀ZnT7聚合，然后與其它魚類和人ZnT7成一簇，再與魚的其他類別ZnT聚合，說明我們分離到的鱸魚ZnT為ZnT7。將鱸魚ZnT的氨基酸序列與與已公布的其他物種ZnT7進行相似性分析，發(fā)現(xiàn)與其他魚類的氨基酸序列相似性從高到低分別為斑馬魚(Daniorerio)85.6%，大西洋鮭(Salmosalar)85.4%，紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)84.3%。與哺乳類的相似性相對略低，如人ZnT7(Homosapiens)為75.1%，與小鼠(Musmusculus)73.8%。

圖3 鱸魚ZnT蛋白的跨膜結構

圖4 鱸魚與其他物種ZnT氨基酸序列進化樹

圖中所用的序列號見表2。

3 討論

ZnT家族和ZIP家族是轉運鋅離子中的兩類重要蛋白，它們的結構特征決定了其在轉運過程中轉運方向的不同：ZnT家族擁有6次跨膜結構域，而ZIP 家族預測含有8次跨膜結構域；ZnT家族胞質C末端結構域比ZIP 家族成員長[2-3]。我們從鱸魚肝臟分離到氨基酸序列分析表明，它具有6個跨膜區(qū)域，而且胞質C末端長達90個氨基酸，所以我們分離到的蛋白屬于ZnT家族。

表2 本文所用到的ZnT基因序列

Note:arefersSalmosalar;brefersmusmusculus。

序列比對分析發(fā)現(xiàn)，我們分離到的鱸魚ZnT氨基酸序列與 ZnT7序列有高度的相似性：斑馬魚，85.6%；大西洋鮭，85.4%；紅鰭東方鲀，84.3%；人，75.1%；小鼠，73.8%。聚類分析顯示鱸魚ZnT首先與其它魚類和人ZnT7成一簇，再與魚的其他類別ZnT聚合，說明我們分離到的鱸魚ZnT為ZnT7。ZnT蛋白的第IV和第V結構域之間的His富集序列使得該蛋白易于結合Zn2+，同時跨膜結構域所形成的小孔使成為Zn2+通過膜的通道[3]。另外，對植物ZnT的研究表明，如果缺失His富集序列會改變所運輸?shù)孜锏奶禺愋訹7-8]。我們發(fā)現(xiàn)，鱸魚ZnT第IV和第V跨膜結構域之間的組氨酸高達26個，大多以(HX)3形式存在，認為該蛋白具有轉運Zn2+的功能的ZnT。

哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)10個ZnT家族成員有10個ZnT 1～10，其中ZnT7定位于高爾基復合體內，將中國倉鼠卵巢細胞(CHO)暴露于含鋅的溶液中，會引起其在高爾基體的累積，表明ZnT7的作用是將鋅從胞漿轉運到高爾基體[9]。堿性磷酸酶是一種含鋅的糖蛋白，以糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的方式連接在質膜上，研究發(fā)現(xiàn)ZnT5和ZnT7對堿性磷酸酶的激活是必需的[10]。ZnT7通過參與鋅離子在高爾基復合體內的聚集和含鋅蛋白質的加工和組裝，是維持神經(jīng)系統(tǒng)鋅穩(wěn)態(tài)的重要ZnT之一[11]。ZnT7基因敲除小鼠大腿肌肉細胞其胰島素信號途徑的活性降低，ZnT7敲除小鼠對食物誘導的葡萄糖耐受表現(xiàn)更為敏感[12]。但是，魚類ZnT7基因的細胞定位尚不清楚，其是否和哺乳動物一樣參與胰島素信號途徑也有待進一步研究。

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Cloning and bioimformatics analysis of cDNA ZnT inLateolabraxjaponicus

SHU Huan-huan, ZHENG Wei-xian, QIAN Yun-xia

(Key Lab of Applied Marine Biotechnology, Minsstry of Education, School of Marine Sciences,Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Zinc transporters family plays important roles in cellular zinc storage, release and distribution. This study described the cloning and sequence analysis of the zinc transporters (ZnT) in the seabass (Lateolabraxjaponicus) using RT-PCR and SMART RACE. The acquired ZnT was 1747 bp in length, including a 84 bp 5′-UTR, a 490 bp 3′-UTR and a 1173 bp coding sequence which could code 390 amino acid. The obtained sequence was postulated to have six transmenbrane domains, an intracellular N-terminus and C-terminus and a His-rich loop between transmembrane domains IV and V. The sequence alignment analysis indicated that the obtained amino acid sequence of ZnT shared high identity with ZnT7s of other species:Daniorerio, 85.6%;Salmosalar, 85.4%;Takifugurubripes, 84.3%;Homosapiens, 75.1%;Musmusculus73.8%. Phylogenetic analysis indicated that the acquired ZnT was first clustered with ZnT7 of teleost and human, then clusterd with other type ZnT of teleost, which showed that the obtained ZnT was type ZnT7.

Lateolabraxjaponicus;ZnT; cloning

2014-05-20；

2014-07-03

浙江省科技廳創(chuàng)新團隊項目(2010R50029)

舒歡歡，碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)動物生物化學與分子生物學研究；

錢云霞，教授，主要從事魚類免疫與營養(yǎng)的研究，E-mail: qianyunxia@nbu.edu.cn。

S965.211,Q343

A

2095-1736(2015)01-0006-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.006