劉 皓, 劉 青, 吳旭干, 何 杰, 董鵬生, 成永旭

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點試驗室，上海 201306;2. 上海海洋大學(xué) 上海高校知識服務(wù)平臺水產(chǎn)動物遺傳育種中心，上海 201306)

中華絨螯蟹兩種微衛(wèi)星DNA分型方法的應(yīng)用比較

劉 皓1, 2, 劉 青1, 吳旭干1, 何 杰1, 董鵬生1, 成永旭1, 2

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點試驗室，上海 201306;2. 上海海洋大學(xué) 上海高校知識服務(wù)平臺水產(chǎn)動物遺傳育種中心，上海 201306)

為對比熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳在微衛(wèi)星等位基因分型上的效果，試驗選擇6對微衛(wèi)星引物，對60個中華絨螯蟹個體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，熒光標(biāo)記法共檢測出等位基因129個，平均每個位點21.5個等位變異，聚丙烯酰胺凝膠電泳共檢測出等位基因174個，平均每個位點29個等位變異。對位點Esin67的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行重復(fù)檢測，發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記法的重復(fù)率為100%，而聚丙烯酰胺凝電泳法兩次結(jié)果存在較大差異，證實了熒光標(biāo)記法檢測的可靠性顯著高于聚丙烯酰胺凝膠電泳。對兩種方法的檢測效率和經(jīng)濟(jì)成本的分析表明，熒光標(biāo)記法雖然成本較高，但效率高于聚丙烯酰胺凝膠電泳法。建立單重PCR的多重毛細(xì)管電泳技術(shù)是提高效率、降低成本的有效途徑。

中華絨螯蟹；微衛(wèi)星；PAGE；熒光標(biāo)記；等位基因

微衛(wèi)星又稱為簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat，SSR)或簡單序列長度多態(tài)(Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP)或短串聯(lián)重復(fù)(Short Tandem Repeats，STR)。微衛(wèi)星標(biāo)記作為一種較為理想的分子標(biāo)記，早在1994年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)在其持續(xù)發(fā)展和管理動物遺傳資源的戰(zhàn)略計劃中, 就將SSR標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具[1]。SSR具有分布廣泛、數(shù)量充足、多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性強、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于物種鑒定，種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、親權(quán)鑒定、基因定位、基因組作圖、數(shù)量性狀位點解析等領(lǐng)域[2-6]。SSR的技術(shù)路線主要包含4個步驟：微衛(wèi)星序列的獲得與引物合成，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的檢測分型，數(shù)據(jù)分析。

在已獲得SSR序列信息轉(zhuǎn)而進(jìn)入大規(guī)模應(yīng)用時，主要工作量便集中在PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測上，SSR等位基因分型方法的選擇直接決定著工作效率、結(jié)果的可靠性及可重復(fù)性。SSR等位基因分型的方法有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳、高分辨率熔解曲線(HRM)等，但應(yīng)用最為廣泛的是PAGE和熒光標(biāo)記法[7]。PAGE法因其操作較為簡單，成本較低，且具有高于瓊脂糖凝膠電泳的分辨率[8]，被認(rèn)為能夠滿足一般的研究需求，但又存在著工作量大、數(shù)據(jù)收集完全依賴人工、同一板膠的等位基因變異易出現(xiàn)識別誤差，以及不同批次不同膠片之間數(shù)據(jù)的統(tǒng)一較為復(fù)雜等缺點，往往導(dǎo)致實驗結(jié)果不夠可靠[9]。熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳具有分析快速、數(shù)據(jù)收集自動化、結(jié)果可靠及重復(fù)性高等優(yōu)點，可以分辨出最低1個bp的序列長度差異，因而精確度更高，但因成本較高，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。為了得到更為精確可靠的SSR等位基因信息，很多研究者都選用了熒光標(biāo)記法進(jìn)行等位基因分型[10-11]。然而，有關(guān)PAGE和熒光標(biāo)記法在SSR分型中的重復(fù)性和可靠性的研究，尚未見報道。

本研究利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)和熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)，選擇6對SSR引物對中華絨螯蟹60個野生個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)，對產(chǎn)物進(jìn)行分型檢測，以比較兩種分型方法的準(zhǔn)確性以及成本和效率。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用長江野生中華絨螯蟹成蟹采集自江蘇鎮(zhèn)江江段，雌雄各半，合計60只，編號為YW1-60，體重在100～150 g之間。取其附肢肌肉固定于95%乙醇中，-20℃保存。

1.2 DNA提取

采用海洋動物基因組DNA提取試劑盒(DP324-03，購于TIANGEN公司)抽提中華絨螯蟹基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳配合核酸蛋白檢測儀檢測質(zhì)量和濃度，ddH2O稀釋為50 ng/μL待PCR用。

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

從已報道的中華絨螯蟹SSR引物[12-13]中選擇6對多態(tài)性高、擴(kuò)增效果好的引物分別合成為普通引物和正向5′端熒光標(biāo)記(FAM或HEX)引物(見表1)。10 μL PCR體系包含50 ng 模板，1 μL 10×PCR buffer，200 μM dNTP，各0.5 μM正反向引物，0.5 U Taq 聚合酶，ddH2O補充體積至10 μL(聚合酶、buffer和dNTP均購于Takara公司)。降落PCR(Touch-down PCR)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性3 min；93℃變性1 min，56～61℃退火30 s，72℃延伸1 min，共2個循環(huán)；93℃變性1 min，54～59℃退火30 s，72℃延伸1 min，共2個循環(huán)；89℃變性1 min，52～57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共5個循環(huán)；89℃變性1 min，50～55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共20～25個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物-20℃保存待用。

表1 6個中華絨螯蟹微衛(wèi)星位點的特征

*—熒光標(biāo)記法中的上游引物 5′端加上 FAM或HEX 熒光標(biāo)記。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測分型

1.4.1 PAGE檢測

配制8%的聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)PCR產(chǎn)物的豐度，調(diào)整加樣量，每板凝膠舍去兩端的若干個加樣孔，僅在中間31個加樣孔加入DL1000Mraker和PCR產(chǎn)物。300 V電泳80 min?？焖巽y染法步驟如下：1)分離凝膠放入托盤，雙蒸水洗5 min；2)倒掉雙蒸水，加入1‰硝酸銀溶液染色8 min；3)倒掉硝酸銀溶液，加入雙蒸水迅速洗滌2次；4)加入適量顯色液(每1000 mL雙蒸水加入0.5 g碳酸鈉，20 g氫氧化鈉，5 mL甲醛溶液)顯色至條帶清晰可見；5)拍照。用Gel-Pro analyzer-4分析照片，讀取目的條帶的長度，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Microsoft excel中，待下一步分析。

1.4.2 熒光標(biāo)記檢測

每兩個加入了不同顏色熒光標(biāo)記的位點的PCR產(chǎn)物混合后，使用甲酰胺變性，以ROX-500作為分子量內(nèi)標(biāo)，使用ABI-3730XL全自動DNA測序儀進(jìn)行檢測分析。GeneMaper-3.5掃描峰圖(見圖1)，讀取目標(biāo)峰所代表的等位基因片段長度，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Microsoft excel中。

圖1 PCR產(chǎn)物混合后的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳與熒光標(biāo)記法檢測效果比較

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)的依據(jù)是基因庫中報道的微衛(wèi)星的重復(fù)類型。使用CONVERT軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Popgene32所需的格式，通過Popgene32分別得出兩種方法檢測到的等位基因個數(shù)(見表2)。在6個中華絨螯蟹微衛(wèi)星座位中，聚丙烯酰胺電泳共檢測出174個等位變異，平均每個位點29個；熒光毛細(xì)管電泳則僅檢測出129個等位變異，平均每個位點21.5個。

表2 兩種分型方法在6個SSR座位中檢測出的等位基因數(shù)

圖2 位點Esin67在YW17中擴(kuò)增產(chǎn)物的2次熒光標(biāo)記法檢測圖譜

Fig 2 Sample YW17′SSR profile of loci Esin67 after two batches capillary electrophoresis detection

選擇SSR位點Esin67的30個PCR產(chǎn)物，再次分別使用兩種方法進(jìn)行分型檢測，作為不同批次條件下檢測結(jié)果的對照。PAGE法第1次檢測出的等位變異個數(shù)為17個，第2次僅檢測到13個等位變異，熒光標(biāo)記法2次檢測得到的等位變異個數(shù)均為11個，每個樣本的檢測結(jié)果均能重復(fù)(見圖2)。就每個樣本中先后檢測到的基因型來看，在本研究中PAGE檢測結(jié)果重復(fù)率較低(見圖3和圖4)。

圖3 位點Esin67擴(kuò)增產(chǎn)物的2次PAGE檢測圖譜

圖4 Esin67 PCR產(chǎn)物2個批次下PAGE分型結(jié)果

Fig 4 Detection results in loci Esin67 by PAGE of two batches

選取位點Esin67的同一個PCR產(chǎn)物，在聚丙烯酰胺凝膠多個點樣孔上樣后進(jìn)行電泳，電泳后讀取條帶，以了解聚丙烯酰凝膠電泳時同一個PCR產(chǎn)物在同一板膠中條帶的變異情況(見圖5和圖6)。

圖5 同一PCR產(chǎn)物多個加樣的PAGE檢測圖譜

圖6 同一PCR產(chǎn)物的2個等位基因在同一板膠中顯示的變異

2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳與熒光標(biāo)記法成本及時效比較

在不考慮儀器購置和儀器損耗的前提下，僅就試劑成本來看，經(jīng)過計算，PAGE方法檢測一個PCR產(chǎn)物的成本為0.13元，熒光標(biāo)記方法的耗費為5.40元(見表3)。在本研究中，熒光標(biāo)記法的試劑成本是PAGE法的數(shù)十倍，其中，熒光引物合成費用占成本的大半。

表3 PAGE和熒光標(biāo)記法檢測360個PCR產(chǎn)物樣本所需試劑成本

對大量樣本而言，工作效率也非常重要，試驗結(jié)果表明兩種方法的工作效率差異很顯著。在本研究的實驗流程和實驗規(guī)模下，以檢測360個PCR產(chǎn)物為例，聚丙烯酰胺凝膠電泳從制膠到最終讀出目的條帶長度耗時約為14.5 h；熒光毛細(xì)管電泳從樣品前處理到讀出目的片段長度耗時約為3.5 h。從時效上看，本研究中熒光毛細(xì)管電泳的工作效率約為聚丙烯酰胺凝膠電泳的4倍。

3 討論

本研究對360份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行兩種方法分型比較，得到了一個有趣的結(jié)果：分辨率較低的PAGE方法檢測到的等位基因個數(shù)反而比分辨率很高的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳要多，且在6對引物中表現(xiàn)出相同的結(jié)果。對同一批PCR產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)檢測，熒光標(biāo)記法具有很強的重復(fù)性，每個樣本的檢測結(jié)果均能重復(fù)，而PAGE法則重復(fù)率較低，同一個PCR產(chǎn)物經(jīng)不同批次的電泳后顯示出了不同的結(jié)果；以同一個PCR產(chǎn)物在同一聚丙烯酰胺凝膠上加多個樣的方式進(jìn)行電泳，則證明了同一等位基因片段在同一板PAGE凝膠上的遷移率也出現(xiàn)一定差異，這就解釋了在本研究中為什么PAGE所檢測到的等位基因數(shù)量比熒光標(biāo)記法多。結(jié)合以上分析，我們推斷： PAGE法用于SSR等位基因檢測時，容易受到凝膠配制和電泳過程中各種理化條件等因素的影響，同時量大而繁瑣的目的條帶數(shù)據(jù)讀取和收集工作同樣會對結(jié)果產(chǎn)生影響，也增加了不同批次、不同膠板間結(jié)果的不一致性，這樣就會導(dǎo)致同一等位基因片段在不同批次中檢測出的片段長度不同；而熒光標(biāo)記法實現(xiàn)了SSR等位基因分型的高通量和自動化，其檢測結(jié)果相對精確和可靠。

當(dāng)面臨大批量樣本的SSR等位基因變異的分型檢測時，工作效率是研究者必須要考慮的因素。就本文中檢測360個樣本的時效來說，熒光標(biāo)記法是PAGE法的4倍，而在郝晨陽等的研究中[9]，這個值高達(dá)7.8，這可能是因為在樣本量更大的情下，加之多重PCR體系的應(yīng)用，熒光標(biāo)記法能夠節(jié)約更多的時間和人工成本，凸顯更高的工作效率。

SSR分型成本是評價分型方法的一個重要指標(biāo)。以本研究結(jié)果為例，熒光標(biāo)記法的試劑成本是PAGE法的數(shù)十倍。在許多SSR應(yīng)用的研究中，樣本量足以千計，而熒光引物合成后可用于更多樣本的PCR擴(kuò)增，這樣就可以有效地減小熒光引物合成對總成本的貢獻(xiàn)率。但總體來說，熒光標(biāo)記法的使用成本較高，一定程度上限制了這種SSR分型方法的使用。探索一種廉價高效的SSR檢測方法，是科研工作者和該技術(shù)廣泛應(yīng)用必需考慮的重要問題。多重PCR體系的應(yīng)用對熒光標(biāo)記法成本的控制及SSR分型的工作效率的提高提供了可能。多重PCR技術(shù)是指在同一PCR體系中同時對多對引物進(jìn)行擴(kuò)增，需要保證所有引物能夠同時擴(kuò)增，引物間不能有相互作用，不同SSR位點的擴(kuò)增產(chǎn)物長度范圍不能重疊，產(chǎn)物濃度相當(dāng)?shù)葪l件[14]。然而，多重PCR體系的成功建立是一個復(fù)雜的摸索過程，需要大量的前期工作?；诙嘀豍CR方法，單重PCR產(chǎn)物混合后的毛細(xì)管電泳可以大大簡化PCR體系建立的摸索過程，只需要將目標(biāo)片段長度范圍不同的位點的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合，然后進(jìn)入毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測[15]，可以達(dá)到多重PCR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳相同的效果，是一種有效降低熒光標(biāo)記法成本的簡便途徑。

綜上所述，熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，分型效果更加高效可靠，為大規(guī)模的SSR標(biāo)記應(yīng)用提供了可能，還可以通過多重PCR或單重PCR產(chǎn)物混合后電泳以降低分型成本。雖然熒光標(biāo)記法試劑價格相對較高，但顯著節(jié)約了人工成本。建立單重PCR產(chǎn)物混合后的毛細(xì)管電泳分型技術(shù)較多重PCR相對易于實現(xiàn)，這是提高分型效率、降低成本的有效途徑。在實際科研工作中，根據(jù)不同物種及等位基因數(shù)量和長度等具體情況，應(yīng)該綜合考慮結(jié)果可靠性、分型效率和成本等多方面因素，選擇一種合適的SSR等位基因分型方法。

[1]Baker J S F. A global protocol for determining genetic distance among domestic livestock breeds[C]. Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, 1994, 21: 501-508.

[2]李曉暉,許志強,潘建林，等.中華絨螯蟹人工選育群體的遺傳多樣性[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2010, 17(2):236-242.

[3]歐陽磊,陳金慧,鄭仁華等.杉木育種群體SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2014,38(1):21-26.

[4]Yang M, Tian C X, Liang X F, et al. Parentage determination of mandarin fish (Sinipercachuatsi) based on microsatellite DNA markers[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2014, 54:285-291.

[5]Chail L J, Biswas M K, Yi H L, et al. Transferability, polymorphism and effectiveness for genetic mapping of the Pummelo (CitrusgrandisOsbeck) EST-SSR markers[J]. Scientia Horticulturae, 2013, 155(29):85-91.

[6]Li Y F, Liu Z Y, Wang Y S, et al. Identification of quantitative trait loci for yellow inner leaves in Chinese cabbage (BrassicarapaL. ssp.pekinensis) based on SSR and SRAP markers[J]. Scientia Horticulturae, 2012, 133(6):10-17.

[7]戴 劍,張云輝. SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法比較及其實驗操作注意事項[J].種子,2013,32(9):120-123.

[8]霍金龍,羅古月,張 娟，等.豬微衛(wèi)星多態(tài)性兩種檢測方法的比較研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,19(3)：314-317.

[9]郝晨陽,王蘭芬,賈繼增，等.SSR熒光標(biāo)記和銀染技術(shù)的比較分析[J].作物學(xué)報,2005,31(2):144-149.

[10]朱澤遠(yuǎn),王亞菊,施用暉，等.熒光標(biāo)記微衛(wèi)星分析人工飼養(yǎng)中華絨螯蟹的遺傳多樣性[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2007,37(4):591-596.

[11]傅建軍,李家樂,沈玉幫，等.草魚野生群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].遺傳,2013,35(2): 192-201.

[12]Hanfling B, Weetman D. Characterization of microsatellite loci for the Chinese mitten crab,Eriocheirsinensis[J]. Molecular Ecology Notes, 2003(3)： 15-17.

[13]Chang Y M, Liang L Q, Li S W， et al. A set of new microsatellite loci isolated from Chinese mitten crab,Eriocheirsinensis[J]. Molecular Ecology Notes, 2006(6): 1237-1239.

[14]公維華,張寧波,程佳月，等.小型豬微衛(wèi)星標(biāo)記多重PCR體系的建立與應(yīng)用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009, 19(2):22-25.

[15]馬雪霞,王 凱,郭旺珍，等.棉花SSR多重PCR技術(shù)的初步研究和利用[J].分子植物育種,2007,5(5):648-654.

Comparison of two detection systems of microsatellite markers in the research of Chinese mitten crabs (Eriocheirsinensis)

LIU Hao1,2, LIU Qing1, WU Xu-gan1, HE Jie1, DONG Peng-sheng1, CHENG Yong-xu1,2

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education,shanghia ocean University, Shanghai 201306; 2. Shanghai Universities Knowledge Service Platform Aquatic Animal Breeding Center, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

360 PCR products of 6 loci among 60 Chinese Mitten Crabs(Eriocheirsinensis)were analyzed by capillary electrophoresis with fluorescent-labeled primers and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), respectively. Total 129 alleles were obtained and 21.5 alleles were detected for every pairs of primers by capillary electrophoresis system, while aggregate 174 and average 29 alleles were detected with PAGE. The repetition rates were at 100% when loci Esin67 was detected for the second time by capillary electrophoresis method, while for PAGE the rates were getting really close to 0, which confirmed that capillary electrophoresis is more reliable than PAGE significantly. More ever, analysis showed that capillary electrophoresis′s material costs and efficiency is higher than PAGE. Establishing a single PCR multiple capillary electrophoresis technology is an effective way to improve efficiency and reduce cost.

Chinese mitten crabs (Eriocheirsinensis); SSR; PAGE; fluorescent-labeled; allele

2014-05-05

2014-06-22

國家863高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目 (2012AA10A409-5)；上海市科委科技崇明專項 (13231203504)；上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目(滬教科2012-62);上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(第二期)項目(滬教科2009-26)

劉 皓,碩士研究生,研究方向為中華絨螯蟹遺傳育種，E-mail:siyuewuyv @sina.com；

成永旭,博士,教授,研究方向為甲殼動物營養(yǎng)繁殖，E-mail: yxcheng@shou.edu.cn。

Q959.1;Q343.1+2;S917.4

B

2095-1736(2015)01-0090-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.090