張玉虹 梁登輝 孫喜斌 李立楠 焦桂清 賈麗英 劉曉娟

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦科(張家口075000)

地諾孕素治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)制分析*

張玉虹 梁登輝 孫喜斌 李立楠 焦桂清 賈麗英 劉曉娟

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦科(張家口075000)

目的：研究地諾孕素治療子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)的信號通路途徑。方法：從2012年3月至2013年3月，將我院180例女性患者的子宮內(nèi)膜組織作為研究對象，根據(jù)子宮內(nèi)膜情況隨機(jī)分成四組，分別為：正常對照組(45例)；正常地諾孕素組(45例)；異位對照組(45例)；異位地諾孕素組(45例)。以3D膠原凝膠培養(yǎng)對各組細(xì)胞在TPL作用凝膠表面積實(shí)施測量，記錄并對比細(xì)胞密度的變化情況。熒光定量測定各組細(xì)胞在經(jīng)地諾孕素作用之后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子基因的表達(dá)。結(jié)果：異位地諾孕素組在作用后的RhoA水平、ROCKⅠ、ROCKⅡ均分別顯著低于異位對照組的，以及正常地諾孕素組的，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。此外，正常地諾孕素組的RhoA水平、ROCKⅠ、ROCKⅡ均分別顯著低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。異位地諾孕素組在作用后的細(xì)胞表面積，均分別顯著小于異位對照組，以及正常地諾孕素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。正常地諾孕素組的細(xì)胞表面積、細(xì)胞密度，均分別顯著小于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論：以地諾孕素治療EMT疾病的主要作用靶點(diǎn)可能位于Rho/ROCK，且地諾孕素可有效抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖及纖維化作用，臨床治療時(shí)應(yīng)予以關(guān)注。

子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)主要特點(diǎn)是子宮內(nèi)膜組織發(fā)生異位生長以及與之相關(guān)的盆腔疼痛和痛經(jīng)，以及不育不孕等。近年來，該病在臨床上的發(fā)病率有上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有80%比例的EMT患者常伴隨有盆腔疼痛，而50%的患者則合并有不孕不育[1]。盡管國內(nèi)外對于EMT進(jìn)行了較多基礎(chǔ)及臨床研究，亦取得了一些進(jìn)展，然而對EMT病因及發(fā)病機(jī)制仍不甚清楚，因此臨床醫(yī)務(wù)工作者們常在治療EMT時(shí)陷入困境，這亦導(dǎo)致EMT逐漸成為了難治之癥，有諸多棘手問題需要解決[2]。有報(bào)道稱[3]，地諾孕素作為一類新藥對EMT疾病有較好療效，然而其具體的作用機(jī)制卻仍需探索。鑒于此，本文主要對地諾孕素對于EMT的相關(guān)機(jī)制的探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料和方法

1 一般資料 從2012年3月至2013年3月，將我院180例女性患者的子宮內(nèi)膜組織作為研究對象，患者年齡均在25～49歲間，平均年齡為51.3±2.9歲。全部患者均為女性，病程為1～15周，平均病程為7.7±2.3周。其中EMT診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]為：①患者有痛經(jīng)癥狀，且呈進(jìn)行性加重，部分患者有不孕和月經(jīng)不調(diào)等癥狀；②經(jīng)婦科檢查顯示子宮增大，附件及結(jié)節(jié)有觸痛感；③B超和腹腔鏡顯示有累及病變。

2 模型制備 子宮內(nèi)膜異位囊腫基質(zhì)細(xì)胞(Endometriosis stromal cells，ECSC)與神經(jīng)干細(xì)胞(Neural crest stem cells，NCSC)分離和培養(yǎng)，以及傳代。實(shí)驗(yàn)組90例取自育齡期患者的子宮內(nèi)膜，且處于增殖的中晚期，并未經(jīng)歷剝除術(shù)的異位性囊腫組織。而對照組90例則取自已排除EMT，并實(shí)施子宮全切除術(shù)女性患者正常的子宮內(nèi)膜處組織。全部患者于手術(shù)前的一年內(nèi)并未應(yīng)用激素治療。自異位于卵巢的子宮內(nèi)膜組織內(nèi)分離出ECSC，并經(jīng)酶消化后得到ECSC，種植于含100IU/ml的青霉素，50mg/ml的鏈霉素，以及10%熱滅活的FBS，DM EM6孔板內(nèi)。在37℃及5% CO2條件下培養(yǎng)，約5～6d細(xì)胞會長滿瓶底，即可傳代。將上清液吸除，以2.5g/L的胰酶消化，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮且變圓之后，吸去消化液，并加入培養(yǎng)液。以吸管吹打瓶壁細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)。ECSCs經(jīng)3代培養(yǎng)之后，純度已大于99%。通過含波形蛋白和CD10，及細(xì)胞角蛋白和第八因子，以及白細(xì)胞共同抗原抗體實(shí)施免疫細(xì)胞的染色。為下列實(shí)驗(yàn)所用。為確保得到足夠數(shù)量細(xì)胞，可選第3代細(xì)胞實(shí)施實(shí)驗(yàn)，且每1次分離后的細(xì)胞進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)。

3 研究方法 將180例實(shí)驗(yàn)品分成4組，分別為①正常對照組(45例)：即正常培養(yǎng)NCSC組；②正常地諾孕素組(45例)：即以TPL50nM進(jìn)行處理的NCSC組；③異位對照組(45例)：即正常培養(yǎng)ECSC組；④異位地諾孕素組(45例)，即以地諾孕素50nM進(jìn)行處理的ECSC組。

4 觀察指標(biāo) 以3D膠原凝膠培養(yǎng)對各組細(xì)胞在TPL作用凝膠表面積實(shí)施測量，記錄細(xì)胞密度的變化情況。熒光定量測定各組細(xì)胞在經(jīng)地諾孕素作用之后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子基因的表達(dá)，其中RhoA(79bp)上游引物為：“CACGCTCAGCACCTTCATTG”，下游引物為：“TTGTCATAGGTCACTTCACACACAC”； ROCKⅠ(190bp)上游引物為：“GCGGGTTTGCCTACAGGTAGATT”，下游引物為：“ACTTGAAAGTGAAAGTCCCTTCCTC”； ROCKⅡ(272bp)上游引物為：“ATGTCCGACCTGTTACTC”，下游引物為：“GTGGCATCTACTGCACTCTA”；β-actin(142bp)上游引物為：“TGGCACCCAGCACAATGAA”，下游引物為：“CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA”。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用美國TaKaPa公司PrimeScrit RNA產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒亦選用該公司SYBR PrimeScript產(chǎn)品，此外兔抗人RhoA多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin多克隆抗體購自美國Invitrogen公司，PT-PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司PRISM 7900HT Realtime型。按有關(guān)說明書步驟嚴(yán)格操作，明確地諾孕素是否通過Rho/ROCK的途徑發(fā)揮其作用。

結(jié) 果

1 各組定量檢測指標(biāo)的關(guān)鍵分子基因表達(dá)水平對比 異位地諾孕素組在作用后的RhoA水平為0.27±0.02，ROCKⅠ為0.32±0.05，ROCKⅡ?yàn)?.27±0.12，均分別顯著低于異位對照組的0.66±0.03，0.75±0.13，0.69±0.08，以及正常地諾孕素組的0.32±0.11，0.35±0.02，0.31±0.02，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。表明地諾孕素可明顯降低EMT患者RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等指標(biāo)的關(guān)鍵分子基因表達(dá)水平。此外，正常地諾孕素組的RhoA水平為0.32±0.11，ROCKⅠ為0.35±0.02，ROCKⅡ?yàn)?.31±0.02，均分別顯著低于正常對照組的0.43±0.02，0.46±0.12，0.36±0.04，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。表明地諾孕素亦可對正常子宮內(nèi)膜干細(xì)胞分子基因的表達(dá)產(chǎn)生一定的降低作用，見表1。

表1 各組定量檢測指標(biāo)的關(guān)鍵

注：與異位地諾孕素組比較，*P<0.05，△P<0.05

2 各組細(xì)胞表面積及細(xì)胞密度水平對比 異位地諾孕素組在作用后的細(xì)胞表面積為211.7±12.3μm2，細(xì)胞密度為11.3±2.5/HP，均分別顯著小于異位對照組的376.5±15.3μm2，17.5±3.3/HP，以及正常地諾孕素組的251.3±11.4μm2，12.7±2.4/HP，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。表明地諾孕素可促進(jìn)有關(guān)變異細(xì)胞逐漸恢復(fù)。此外，正常地諾孕素組的細(xì)胞表面積為251.3±11.4μm2，細(xì)胞密度為12.7±2.4/HP，均分別顯著小于正常對照組的284.3±10.5μm2及15.4±1.2/HP，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表2。

表2 各組細(xì)胞表面積及細(xì)胞密度水平對比

注：與異位地諾孕素組比較，*P<0.05，△P<0.05

討 論

現(xiàn)如今， EMT治療目前仍無治愈藥物，僅可緩解有關(guān)癥狀，臨床上主要是針對不孕及疼痛，并依照患者實(shí)際情況加以選擇相應(yīng)的手術(shù)及藥物，控制患者疼痛，降低復(fù)發(fā)。朱琴等[5]報(bào)道稱，可選藥物主要集中在怎樣降低患者機(jī)體雌激素水平的活性方面，故其引發(fā)的高復(fù)發(fā)率逐漸成為了臨床上明顯的問題。隨著人們對EMT認(rèn)識程度的加深，有關(guān)學(xué)者從EMT發(fā)病機(jī)制涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等問題入手，通過分子治療EMT的方案不斷得到人們關(guān)注[6]。在EMT發(fā)生及發(fā)展過程中，纖維組織發(fā)生過度增殖及纖維化致使瘢痕形成，從而導(dǎo)致慢性疼痛及組織功能的變化[7]。因此，纖維組織的增殖及纖維化可視作EMT特征性病變，故闡明與其有關(guān)的纖維化發(fā)展?jié)撛跈C(jī)制，找尋一類較為理想的可預(yù)防、減輕亦或是逆轉(zhuǎn)EMT的治療方案，已稱為EMT治療時(shí)急待解決的問題[8]。

Rho-Rock是普遍存于機(jī)體各組織內(nèi)的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其關(guān)鍵分子主要含Rho、Rock及肌球蛋白磷酸酶[9]。哺乳動物的細(xì)胞中，含20種以上不同Rho蛋白，但主要以對RhoA、Racl和Cdc42的研究最為廣泛。國外有報(bào)道表明[10]，Rho-Rock通路與EMT的進(jìn)展有較大聯(lián)系，且與纖維組織發(fā)生的過度纖維化有關(guān)，因此本文將Rho-Rock通路作為對EMT疾病的研究對象。

地諾孕素是一類混合型孕激素，其可用作臨床治療EMT疾病，可同時(shí)發(fā)揮天然及合成性孕激素的藥理學(xué)優(yōu)點(diǎn)。Thomas等指出，在緩解EMT疼痛上，地諾孕素療效可相當(dāng)于醋酸亮丙瑞林，而其安全性及耐受性相對更佳[11]。

本文通過研究發(fā)現(xiàn)，異位地諾孕素組在作用后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等指標(biāo)的關(guān)鍵分子基因表達(dá)水平均下降，且異位地諾孕素組在作用后的細(xì)胞表面積及細(xì)胞密度均顯著低于其他各組。表明地諾孕素的抗纖維化效果主要由Rho/ROCK途徑實(shí)現(xiàn)，其具有抑制細(xì)胞的增殖及纖維化的有關(guān)分子機(jī)制，對治療EMT疾病有一定療效。與Luong等[12]報(bào)道結(jié)果一致，究其原因，筆者認(rèn)為主要可能是以下幾方面：①Rho家族蛋白為細(xì)胞信號在轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號轉(zhuǎn)換器及分子開關(guān)。其可重組肌動蛋白骨架蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞生長和形態(tài)，及運(yùn)動和粘附，以及轉(zhuǎn)移與細(xì)胞外基質(zhì)的收縮。②將3D膠原凝膠立體培養(yǎng)體系應(yīng)用于ECSC，成功構(gòu)建了EMT纖維化形成的細(xì)胞模型。ECSC具有獨(dú)特生物學(xué)特性，其較NESC具有更強(qiáng)收縮性，并且其促纖維化能力是因Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。而這可能是Rock的選擇性抑制劑Fasudil抑制ECSC的增殖、收縮，誘發(fā)ECSC凋亡，并且抑制ECSC向肌纖維母細(xì)胞分化而形成的。Machairiotis等報(bào)道證實(shí)，Rho-Rock通路選擇性阻斷劑Y-27632可以改善腎、肺及肝纖維化的程度，這亦表明了Rho-Rock信號通路確實(shí)參與纖維化發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程。而De-Vos等亦研究證實(shí)異位子宮內(nèi)膜有關(guān)間質(zhì)細(xì)胞可分化為α-SMA洋相肌纖維母細(xì)胞，經(jīng)地諾孕素治療后分化能力明顯下降，與本文報(bào)道基本一致。

綜上所述，以地諾孕素治療EMT疾病的主要作用靶點(diǎn)可能位于Rho/ROCK，且地諾孕素可有效抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖及變異作用，臨床治療時(shí)應(yīng)予以關(guān)注。

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(收稿：2014-03-29)

*河北省張家口市科學(xué)技術(shù)和地震局科研項(xiàng)目(1321081D)

子宮內(nèi)膜異位癥/治療 @地諾孕素 信號傳導(dǎo)

R711.71

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.006