陳沃俊,張志遠,鄧翔云,張妙齊,曾藹寧,冼偉杭,陳勝鋒,陳志勝,計慧琴,劉璨穎,張 暉,白銀山,王丙云

(佛山科學技術學院 生命科學與工程學院,廣東佛山 528000)

母豬批次化生產(chǎn)管理是現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖的關鍵,通過人為控制,實現(xiàn)對豬群繁育過程的同步管理,使同一批次的母豬同期發(fā)情、同期排卵、同期配種、同期妊娠以及同期分娩。烯丙孕素(altrenogest)是母豬批次化生產(chǎn)管理中同步發(fā)情環(huán)節(jié)的關鍵藥物,是一種人工合成的21碳甾體類孕激素[1-2]。烯丙孕素的作用機理與天然黃體酮相似,給藥期間能抑制腦垂體分泌促性腺激素,從而阻止卵泡發(fā)育以及母豬發(fā)情。停藥后,腦垂體恢復促性腺激素的分泌,母豬恢復發(fā)情和卵泡發(fā)育[3-5]。由于其水溶性差,生物利用度低,因此需要頻繁給藥以維持有效藥物濃度,在臨床應用時通常以20 mg/d的劑量連續(xù)給藥18 d,給豬場添加了許多工作量。

微球(microsphere)作為藥物載體的研究始于20世紀70年代中期,具有靶向性、緩釋長效性以及能掩蓋藥物不良氣味等優(yōu)點,是一種良好的藥物載體[6]。用于制備微球的包材種類繁多,其中單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物(polyethylene glycol monomethyl ether-polylactic acid,mPEG-PLA)具有良好的生物相容性和可生物降解性,最終可完全降解為CO2和H2O排出體外,不會在動物體內(nèi)積聚產(chǎn)生毒副作用,是一種新型控制藥物釋放的載體材料[7]。mPEG-PLA是FDA批準的一類藥物輔料,已廣泛用于生物醫(yī)學,特別是藥物輸送系統(tǒng)領域,在臨床上取得了較好效果[8]。另外,以mPEG-PLA作為載體材料制備的微粒制劑具有良好的緩釋性能,Zhang等使用乳化-溶劑揮發(fā)法制備三七總皂苷/mPEG-PLA微球,經(jīng)體外釋放試驗證明三七總皂苷/mPEG-PLA微球穩(wěn)定、長效釋放24 d,并能在60 d內(nèi)降解[9]。

本試驗擬采用mPEG-PLA為載體材料,通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備烯丙孕素緩釋微球,達到烯丙孕素在母豬體內(nèi)緩慢長效釋放、提高其生物利用度、減少臨床給藥次數(shù)和降低養(yǎng)殖成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 烯丙孕素原料藥,純度為98%,上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;烯丙孕素對照品(批號160415),純度99%以上,購自中國獸醫(yī)藥品標準物質(zhì)訂購平臺。

1.1.2 主要試劑 mPEG2000-PLLA10000,相對分子質(zhì)量約為12 000,下文統(tǒng)稱mPEG-PLA,濟南岱罡生物工程有限公司產(chǎn)品;明膠、吐溫-80,均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;二氯甲烷,天津市大茂化學試劑廠產(chǎn)品;無水乙醇,天津市百世化工有限公司產(chǎn)品;乙腈,美國天地有限公司產(chǎn)品。乙腈為色譜純,其余藥品與試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 電動恒速攪拌器(LC-OES-60SH),購自上海力辰邦西儀器科技有限公司;電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;臺式離心機(TG16-WS),湖南湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品;真空冷凍干燥機(德國Cheist Alpha 1-4 LSC),購自Marin Christ公司;RC-6溶出度測定儀,天津天光光學儀器有限公司產(chǎn)品;LC-15C高效液相色譜儀,日本島津公司產(chǎn)品;馬爾文激光粒度儀Mastersizer3000,英國馬爾文帕納科公司產(chǎn)品;綜合藥物穩(wěn)定性試驗箱(WYH-100Z),購自杭州旌斐儀器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烯丙孕素緩釋微球的制備及工藝優(yōu)選 制備方法:采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備烯丙孕素緩釋微球。烯丙孕素緩釋微球制備的全過程需要在避光條件下進行。將適量的烯丙孕素和mPEG-PLA溶解于二氯甲烷,作為油相;將適量明膠和吐溫-80溶解于純水,作為水相。將水相緩慢加入到處于持續(xù)攪拌狀態(tài)的油相中,形成O/W型乳劑,在常溫下攪拌至二氯甲烷全部揮發(fā)。收集二氯甲烷揮發(fā)完全后的產(chǎn)物,4 000 r/min離心10 min后,用純水洗滌3次,離心收集洗滌后的產(chǎn)物,真空冷凍干燥后即得烯丙孕素緩釋微球。

制備工藝優(yōu)選:在單因素試驗的基礎上,挑選出對烯丙孕素制備影響較大的5個因素(攪拌速度、水相中吐溫-80含量、mPEG-PLA質(zhì)量濃度、油水體積比、水相中明膠含量),每個因素設置5個水平進行正交試驗設計,表1為正交試驗因素與水平表。使用SPSS 17.0設計L25(55)正交表,并以包封率為評價指標,篩選烯丙孕素緩釋微球的最佳制備條件。

表1 正交試驗設計因素與水平

1.2.2 烯丙孕素標準曲線的繪制 高效液相色譜條件:Ecosil C18色譜柱(5 μm,4.6×250 mm,120ACUXE),其余色譜條件參考黃忠等烯丙孕素含量測定的色譜條件[10]。

標準曲線的建立:精密稱取10 mg的烯丙孕素對照品,用無水乙醇溶解并稀釋,配制成3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的烯丙孕素對照品工作液,用0.22 μm的有機系針筒式過濾器過膜后,按照上述的色譜條件進行分析。以色譜峰面積為縱坐標,以烯丙孕素對照品濃度為橫坐標進行線性回歸,得到標準曲線圖和線性回歸方程。

1.2.3 包封率和載藥量的測定 準確稱取10 mg烯丙孕素緩釋微球于10 mL棕色容量瓶中,加入1 mL二氯甲烷并在30℃的條件下超聲15 min后,加入無水乙醇定容。用0.22 μm的有機系針筒式過濾器過膜后,按照1.2.2所述的色譜條件進樣分析。載藥量和包封率計算公式如下:

載藥量(%)=提取液藥物濃度×提取液總體積/烯丙孕素緩釋微球質(zhì)量(10 mg)

包封率(%)=載藥量×烯丙孕素緩釋微球總質(zhì)量/烯丙孕素投藥量

1.2.4 烯丙孕素緩釋微球形態(tài)觀察與粒徑測定 參考李希凱等[11]微球形態(tài)觀察的掃描電鏡條件,并使用馬爾文激光粒度儀Mastersizer3000測定烯丙孕素緩釋微球的平均粒徑,并記錄粒徑分布圖。

1.2.5 烯丙孕素緩釋微球的體外釋放試驗及體外釋放曲線方程擬合 溶出度測定方法按照《中國獸藥典》2015版溶出度測定法第二法漿法,溶出介質(zhì)分別為含1%吐溫-80 pH 1.2的鹽酸緩沖溶液、含1%吐溫-80 pH 4.1的乙酸緩沖溶液以及含1%吐溫-80 pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液各900 mL,溶出溫度為37℃±0.5℃,轉(zhuǎn)速100 r/min,烯丙孕素緩釋微球的添加質(zhì)量為1 000 mg,分別于0.25、0.5、1、2、3、4 h取樣1 mL,并迅速向溶出杯內(nèi)添加相同體積相同溫度的溶出介質(zhì),使用高效液相色譜法測定樣品中烯丙孕素的藥物濃度,并換算成累計釋藥量,繪制體外釋放曲線。

體外釋放曲線方程擬合:以時間t為橫坐標,累計釋藥量M為縱坐標,按照固定的公式,使用Origin 2018擬合成零級釋放方程、一級釋放方程以及Higuchi方程。

1.2.6 烯丙孕素緩釋微球的藥物穩(wěn)定性影響因素試驗

1.2.6.1 高溫試驗 將烯丙孕素緩釋微球裝于棕色西林瓶中,開口放置于60℃下10 d,于第5天和第10天取樣,考察烯丙孕素緩釋微球性狀以及烯丙孕素含量的變化。

1.2.6.2 高濕試驗 將烯丙孕素緩釋微球裝于棕色西林瓶中,開口放置于25℃,相對濕度90%±5%的條件下10 d,于第5天和第10天取樣,考察烯丙孕素緩釋微球性狀以及烯丙孕素含量的變化,同時準確稱取試驗前后烯丙孕素緩釋微球的重量,計算烯丙孕素緩釋微球樣品的吸濕增重,以考察烯丙孕素緩釋微球的吸濕潮解性能。

1.2.6.3 強光照射試驗 將烯丙孕素緩釋微球裝于棕色西林瓶中,開口放置于照度為4500 lx±500 lx的光照裝置中10 d,于第5天和第10天取樣,考察烯丙孕素緩釋微球性狀以及烯丙孕素含量的變化。

2 結果

2.1 烯丙孕素標準曲線的建立

由圖1可知,在3.125～100 μg/mL范圍內(nèi),烯丙孕素濃度與峰面積的線性回歸方程為y=28 067x+23 350,R2=0.999 7,線性關系良好,符合檢測要求。

圖1 烯丙孕素標準曲線

a.烯丙孕素;b.空白微球;c.空白微球表面;d.烯丙孕素緩釋微球;e.烯丙孕素緩釋微球表面

2.2 烯丙孕素緩釋微球的制備工藝優(yōu)選

正交試驗結果表明,烯丙孕素緩釋微球的最佳制備工藝為A4B1C4D5E1,即攪拌速度1 000 r/min,吐溫-80含量0.2%,mPEG-PLA質(zhì)量濃度0.07 g/mL,油水體積比0.6,水相中明膠含量1.0%。根據(jù)正交試驗得到的最佳制備條件制備3批烯丙孕素緩釋微球并測定它們的包封率和載藥量,最佳制備條件下,烯丙孕素緩釋微球的平均包封率為(95.64±0.23)%(n=3),平均載藥量為(9.83±0.61)%(n=3),mPEG-PLA對烯丙孕素的包埋效果達到最佳。

2.3 微球的形態(tài)觀察及粒徑分析

掃描電鏡結果顯示,烯丙孕素原藥呈晶體狀,空白微球與烯丙孕素緩釋微球呈球形,空白微球表面有裂紋,而烯丙孕素緩釋微球成球性較好,外觀圓整。與空白微球相比,烯丙孕素緩釋微球表面呈絨毛狀,可能為吸附于微球表面的藥物,且烯丙孕素緩釋微球表面具有許多微孔。

烯丙孕素緩釋微球的粒徑分布圖如圖3所示,烯丙孕素緩釋微球的大小主要分布于20～180 μm范圍內(nèi),平均粒徑為82.3 μm。

圖3 烯丙孕素緩釋微球的粒徑分布圖

2.4 烯丙孕素緩釋微球的體外釋放及釋放曲線方程擬合

由圖4可知,烯丙孕素緩釋微球能分別在含有1%吐溫-80 pH為1.2的鹽酸緩沖液、含有1%吐溫-80 pH為4.1的醋酸緩沖液以及含有1%吐溫-80 pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中持續(xù)釋放4 h以上,4 h內(nèi)烯丙孕素緩釋微球在3種不同pH的釋放介質(zhì)中的累計釋藥量分別達82.37%、92.80%、96.10%。烯丙孕素緩釋微球在1 h內(nèi)釋藥較快,而1 h后,烯丙孕素緩釋微球的釋藥速度減慢,且在pH 1.2的鹽酸緩沖液中的釋放量低于另外兩種溶出介質(zhì)。

圖4 不同釋放介質(zhì)下烯丙孕素緩釋微球的體外釋放曲線(n=3)

烯丙孕素緩釋微球的體外釋放曲線方程擬合結果如表3所示,可以明顯看出,烯丙孕素緩釋微球在3種不同pH的溶出介質(zhì)中的溶出曲線更符合一級釋放模型,擬合效果最佳,而與零級釋放方程以及Higuchi方程的擬合效果較差。所以,烯丙孕素緩釋微球的釋放機理符合一級動力學方程,具有一定的緩釋效果。

表3 烯丙孕素緩釋微球體外釋放曲線方程擬合

表4 烯丙孕素緩釋微球藥物穩(wěn)定性的影響因素

2.5 烯丙孕素緩釋微球藥物穩(wěn)定性的影響因素

由藥物穩(wěn)定性影響因素試驗結果可知,高濕的條件對烯丙孕素緩釋微球的藥物穩(wěn)定性影響較小,烯丙孕素含量無明顯降低,且無吸濕結晶的現(xiàn)象出現(xiàn),而保存在高溫以及強光照射的條件下對烯丙孕素緩釋微球中烯丙孕素的含量有著明顯影響,在60℃的環(huán)境中儲存10 d后,烯丙孕素的含量減少3.00%,在照度4500 lx±500 lx的條件下儲存10 d后烯丙孕素的含量減少更為顯著,達到11.92%。因此,烯丙孕素緩釋微球需要在低溫陰暗的環(huán)境下儲存。

3 討論

在烯丙孕素緩釋微球的制備時,mPEG-PLA的理化性質(zhì)如分子量、聚合物的比例等對微粒的粒徑、包封率及降解速率直接相關,如低分子量的聚合物表現(xiàn)出較高的藥物釋放速率以及降解速率[12],因此在考慮mPEG-PLA性能及經(jīng)濟效益的同時,本試驗選取mPEG2000-PLLA10000進行研究。在mPEG-PLA溶劑的選擇上,本試驗考察了mPEG-PLA分別在乙醇、甲醇以及二氯甲烷中的溶解效果,結果表明,mPEG-PLA在二氯甲烷中的溶解效果最佳,且二氯甲烷具有強揮發(fā)性,可加快烯丙孕素緩釋微球的制備速度。

本試驗經(jīng)過工藝優(yōu)選制備得到的烯丙孕素緩釋微球包封率和載藥量高,優(yōu)于其他同為mPEG-PLA為載體制備的載藥微球[13],高包封率歸功于烯丙孕素的脂溶特性,因此烯丙孕素易于保留在微球的有機相內(nèi)。最佳制備條件下,微球的平均粒徑較小,但是粒徑跨距較大,這可能是殘留的明膠顆粒造成的,后續(xù)試驗將進一步優(yōu)化烯丙孕素緩釋微球的分離工藝以達到均勻粒徑的目的。

長效載藥微球在體內(nèi)的釋藥時間較長,因此需要進行體外加速釋放試驗對其釋藥特點進行研究,從而快速評價載藥微球的釋藥方式,加快研發(fā)、生產(chǎn)進程[13]。另外,根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定,對于難溶性藥物,可在溶出介質(zhì)中添加適量的表面活性劑。經(jīng)過篩選,在溶出介質(zhì)中添加1%的吐溫-80既可以使烯丙孕素滿足在溶出介質(zhì)中的漏槽條件,而且能加快烯丙孕素緩釋微球的藥物釋放。在體外釋放試驗中,烯丙孕素緩釋微球的釋放曲線符合一級釋放模型,具有緩釋效果,但烯丙孕素緩釋微球在初始階段釋藥速度較快,主要原因有以下兩點:(1)藥物在微球中主要以吸附、鑲嵌和包埋的方式存在,微球表面吸附的藥物快速釋放是初始階段出現(xiàn)“突釋效應”的主要原因,PU等[14]通過共聚焦顯微鏡觀察黃體酮微球中黃體酮的分布情況,發(fā)現(xiàn)黃體酮在微球表面分布十分密集,本試驗中烯丙孕素緩釋微球和空白微球的電鏡結果也證明,烯丙孕素緩釋微球的表面吸附著大量的烯丙孕素原藥;(2)微球粒徑是影響藥物釋放的重要因素,球徑越小,釋放速度越快[15-16]。后續(xù)的研究應進一步改進烯丙孕素緩釋微球的制備工藝,優(yōu)化烯丙孕素緩釋微球中藥物的存在形式,以降低突釋的影響。

烯丙孕素一個重要的理化性質(zhì)是在光照條件下易發(fā)生化學結構的轉(zhuǎn)化,導致其活性喪失[17]。本研究使用mPEG-PLA對烯丙孕素進行包埋,能減緩微球內(nèi)部的藥物光解的速度,增強藥物在光照條件下的穩(wěn)定性,但微球表面吸附有部分藥物,因此在光照穩(wěn)定性試驗中主要是微球表面的烯丙孕素分解而導致藥物含量的下降。烯丙孕素緩釋微球在高溫條件下穩(wěn)定性一般,在高濕條件下穩(wěn)定性良好,因此烯丙孕素緩釋微球需要在低溫、避光的條件下儲存。

Li Y等[18]進行了國產(chǎn)與進口兩種烯丙孕素口服溶液的藥代動力學比較研究,結果顯示,兩種烯丙孕素口服溶液的消除半衰期分別為3.63 h±0.72 h和3.45 h±0.63 h,可見,現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)常用的烯丙孕素制劑體內(nèi)半衰期短,消除速度快,而烯丙孕素緩釋微球研究不僅有助于解決烯丙孕素的這些缺點,提高生物利用度,更為烯丙孕素長效制劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

綜上所述,在最佳制備條件下烯丙孕素緩釋微球的包封率高,載藥量好,外觀圓整,粒徑較小。烯丙孕素緩釋微球具有緩釋效果,需要在避光、低溫條件下保存。