曹慧玲，滕鳳猛，汪小蓉，顧萬建，張春兵

（江蘇省中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 210029）

PEI與脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染的比較研究

曹慧玲，滕鳳猛，汪小蓉，顧萬建，張春兵

（江蘇省中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 210029）

目的比較新型轉(zhuǎn)染試劑陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）與脂質(zhì)體2000介導的血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF165基因轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T的轉(zhuǎn)染效率，為基因轉(zhuǎn)染提供新的方法。方法分別采用脂質(zhì)體和不同N/P比值的PEI將合成的含有綠色熒光蛋白（GFP）和VEGF165的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞。轉(zhuǎn)染24h后，采用CCK－8試劑盒檢測細胞活性；轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察比較兩種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率，并通過ELISA方法檢測細胞上清液中VEGF165濃度，比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果當N/P＝9時，PEI轉(zhuǎn)染的細胞活性與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相近，對細胞的毒性較??；此時，PEI轉(zhuǎn)染效率與脂質(zhì)體也相似，均可達到約70%；同樣，轉(zhuǎn)染后細胞上清中VEGF165濃度較未轉(zhuǎn)染組提高（P＜0.05），但兩種方法轉(zhuǎn)染組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論PEI作為一種新型的轉(zhuǎn)染試劑，與脂質(zhì)體相比，在一定比例范圍內(nèi)，具有轉(zhuǎn)染效率高，對細胞毒性小且價格低廉的優(yōu)勢，有望成為基因轉(zhuǎn)染的有效載體。

聚乙烯亞胺； 脂質(zhì)體； 基因轉(zhuǎn)染； 轉(zhuǎn)染效率

基因轉(zhuǎn)染需要一定的轉(zhuǎn)染試劑將帶有目的基因的載體運送至細胞內(nèi)。目前，應用最廣泛的轉(zhuǎn)染試劑是陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，它們?nèi)菀淄ㄟ^細胞膜，在通過細胞屏障方面跟病毒有很相似的特征。陽離子脂質(zhì)體在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，應用也最為廣泛。然而在體內(nèi)，它會被迅速清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強烈的抗炎反應，具有毒性，這使其應用受到限制。由于陽離子脂質(zhì)體使用的局限性，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑日益受到關(guān)注，聚乙烯亞胺（PEI）就是這樣一類轉(zhuǎn)染試劑［1］。PEI中的N元素與質(zhì)粒DNA中P元素的摩爾數(shù)的比值（N/P比值）是影響PEI轉(zhuǎn)染效率的重要因素。本研究旨在觀察不同N/P比值PEI的轉(zhuǎn)染效率及其對細胞活性的影響并與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行比較，從而為擴大其應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 293T細胞由南京醫(yī)科大學惠贈。PEI分支型，相對分子質(zhì)量為25×103，為Sigma公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；VEGF165質(zhì)粒［攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因］，由本實驗室構(gòu)建，見圖1；CCK－8試劑盒為日本同仁公司生產(chǎn)；高糖DMEM培養(yǎng)液為Hyclone公司生產(chǎn)；胎牛血清為Hyclone公司生產(chǎn)；胰蛋白酶為Sigma公司生產(chǎn)；VEGF165 ELISA試劑盒為R＆D公司生產(chǎn)；PBS緩沖液購自南京天為公司。

1.2 方法

1.2.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合液配制 取無血清DMEM 100μL，加入質(zhì)粒DNA 8μg，室溫放置5min，取10μL脂質(zhì)體2000加入無血清DMEM 100μL，放置5min，將二者混合后放置20 min，備用。

1.2.2 PEI轉(zhuǎn)染混合液配制 取無血清DMEM 100μL，加入質(zhì)粒DNA 8μg，放置5min，另根據(jù)不同N/P比值將PEI稀釋至不同質(zhì)量濃度，加入無血清DMEM 100μL中，放置5min，將兩者混合，邊加入邊震蕩，混合后放置20min，備用。

1.2.3 N/P比值的優(yōu)化 本實驗所用DNA質(zhì)量為8μg，根據(jù)公式：N/P＝PEI（μg）/DNA（μg）×7.75進行計算，所需PEI的質(zhì)量見表1。

1.2.4 細胞培養(yǎng) 293T細胞培養(yǎng)于DMEM［含10%胎牛血清（FBS）中］，置于37℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24 h將細胞接種于6孔板中，每孔5×105個細胞且均勻分布，用于轉(zhuǎn)染。

1.2.5 293T細胞轉(zhuǎn)染 取6孔板細胞，PBS緩沖液洗滌兩次，轉(zhuǎn)染組細胞分別加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合液和PEI轉(zhuǎn)染混合液，對照組加入等量無血清DMEM，邊加邊混勻，37℃，5% CO2培養(yǎng)6h。轉(zhuǎn)染后去除轉(zhuǎn)染混合液，每孔加入完全培養(yǎng)基2mL繼續(xù)培養(yǎng)，48h后檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.2.6 細胞活性檢測 采用CCK－8試劑盒進行檢測。取轉(zhuǎn)染48h的細胞接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后，每孔加入CCK－8檢測試劑10μL，37℃孵育4h，酶標儀檢測吸光度（A）值。

1.2.7 轉(zhuǎn)染后綠色熒光觀察 在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染48h后帶有綠色熒光的細胞比例，有綠色熒光說明轉(zhuǎn)染成功。

1.2.8 ELISA檢測培養(yǎng)上清VEGF165 取轉(zhuǎn)染48h后細胞培養(yǎng)上清，按照VEGF165ELISA試劑盒說明書操作，得到培養(yǎng)上清中VEGF165的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞活性檢測 PEI轉(zhuǎn)染組細胞活性隨N/P比值的升高而降低，N/P＝9時接近脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，而所有轉(zhuǎn)染組細胞較未轉(zhuǎn)染組細胞活性均有所降低，但除N/P＝11時外，其他N/P比值的PEI轉(zhuǎn)染與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染效率 熒光顯微鏡觀察到未轉(zhuǎn)染組未見綠色熒光蛋白表達（轉(zhuǎn)染率為0%），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組可見大部分細胞表達綠色熒光蛋白（轉(zhuǎn)染率約為70%），PEI轉(zhuǎn)染組也可見大量細胞表達GFP（轉(zhuǎn)染率約為75%），可見兩種轉(zhuǎn)染試劑均能達到較高的轉(zhuǎn)染效率，見附圖1（見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）。

2.3 細胞上清液VEGF165的濃度 轉(zhuǎn)染48h后，ELISA法檢測細胞上清液中VEGF165的濃度，見表3。VEGF165的濃度隨N/P比值的增高而增加，當N/P＝9時，PEI轉(zhuǎn)染結(jié)果與脂質(zhì)體相似，較未轉(zhuǎn)染組有明顯升高（P＜0.01）。

表2 各組的細胞活性檢測結(jié)果（pg/mL，）

＊：P＜0.05，與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組比較；－：無數(shù)據(jù)。

檢測結(jié)果PEI轉(zhuǎn)染組分組－N/P＝0 3.28±0.34 N/P＝1 3.21±0.32 N/P＝3 3.15±0.27 N/P＝5 3.01±0.28 N/P＝7 2.93±0.22 N/P＝9 2.87±0.25 N/P＝11 2.24±0.30＊脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組 2.89±0.28未轉(zhuǎn)染組3.29±0.36

）表3 細胞上清液中VEGF165的檢測（pg/mL，

－：無數(shù)據(jù)。

分組 VEGF165水平PEI轉(zhuǎn)染組 －N/P＝0 5.8±0.46 N/P＝1 9.2±0.11 N/P＝3 23.7±2.34 N/P＝5 67.9±5.53 N/P＝7 147.1±8.24 N/P＝9 241.5±14.76 N/P＝11 235.0±17.55脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組 240.3±16.65未轉(zhuǎn)染組6.1±0.54

3 討 論

PEI是人工合成的含有極高密度正電荷的有機大分子陽離子聚合物。PEI與DNA通過正負電荷的相互吸引形成復合物［2］，是較為有效的聚陽離子型基因載體，轉(zhuǎn)染效率高，常輔助超聲等物理方法攜帶外源基因進入目的細胞［3－4］。然而，隨著PEI用量的增大，其細胞毒性也隨之升高。同樣，應用最多的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法與PEI轉(zhuǎn)染有著相似的特性。但脂質(zhì)體往往價格較高，相比較而言，PEI價格較低，在適當?shù)谋壤拢部砂l(fā)揮較好的轉(zhuǎn)染效果［5］。

胡偉等［6］比較了PEI與陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人舌鱗癌細胞的轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性，研究發(fā)現(xiàn)在各自最佳轉(zhuǎn)染條件下，PEI轉(zhuǎn)染效率更高，細胞毒性小。為了進一步了解PEI作為新型轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)勢，本研究以293T作為轉(zhuǎn)染細胞，通過觀察質(zhì)粒載體上GFP和VEGF165的表達情況，比較了脂質(zhì)體、PEI兩種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率。細胞活性檢測結(jié)果顯示，較未轉(zhuǎn)染細胞的細胞活性而言，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞活性均有所降低，且隨著N/P比值的增加PEI對細胞的毒性也逐漸加大。但是當PEI控制在一定范圍內(nèi)，與未轉(zhuǎn)染組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。同時，研究表明當PEI濃度為N/P＝9時，對細胞活性的影響與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法接近，說明在一定比例范圍內(nèi)，PEI毒性對細胞活性的影響不大。熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，兩種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率均達到70%（產(chǎn)生綠色熒光的細胞即轉(zhuǎn)染陽性細胞占總細胞的比例），與脂質(zhì)體相比，一定N/P比值的PEI轉(zhuǎn)染同樣具有較好轉(zhuǎn)染效果。攜帶VEGF165基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細胞，培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染細胞可表達VEGF165相應蛋白，并分泌入細胞上清中，使得細胞上清中VEGF165的含量增加，增加程度與熒光結(jié)果相一致。本研究顯示，加入適當N/P比值的PEI后，兩種方法轉(zhuǎn)染后細胞上清液中的VEGF165水平與未轉(zhuǎn)染組比較，均顯著提高，再次驗證了PEI與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染具有較高的轉(zhuǎn)染效率，且轉(zhuǎn)染效果相似。

目前，PEI及其相關(guān)復合試劑廣泛應用于醫(yī)學的各個領(lǐng)域［7］，Liang等［8］認為PEI與普流尼克通過表面交聯(lián)可以達到更好的轉(zhuǎn)染效果；Shao等［9］學者則利用PEI包裹病毒樣顆粒介導isRNA用于治療乳腺癌研究；Liu等［10］利用PEI－PEG將DNA及藥物特異性導入腫瘤細胞；傅曉源等［11］制備了PEI載基因納米顆粒并研究其理化性質(zhì)及體外活性。本文的研究也提示，在適合的比例下PEI可以替代脂質(zhì)體，作為新型有效的轉(zhuǎn)染試劑用于實驗研究中。

PEI作為新型轉(zhuǎn)染試劑，其細胞毒性一定程度上制約了其的應用，因此，有更多的研究者提出對PEI的加入量加以控制（N/P比值）或?qū)ζ溥M行重新構(gòu)建，以減少其對細胞活性的影響［12］。

綜上所述，通過比較陽性聚合物PEI與脂質(zhì)體2000兩種轉(zhuǎn)染試劑分別介導VEGF165質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，說明PEI在適當?shù)腘/P比值時，可以達到與脂質(zhì)體同樣或更好的轉(zhuǎn)染效果，如將PEI加以改造，構(gòu)建新的復合轉(zhuǎn)染試劑，可有效降低PEI的生物毒性，使其應用更為廣泛。由于PEI較脂質(zhì)體而言具有轉(zhuǎn)染效率高且經(jīng)濟實惠的優(yōu)勢，提示其可作為新型的轉(zhuǎn)染試劑廣泛應用于醫(yī)療領(lǐng)域。

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Comparison of gene transfection reagents between PEI and lipofectamine

Cao Huiling，Teng Fengmeng，Wang Xiaorong，Gu Wanjian，Zhang Chunbing
（Department of Clinical Laboratory，Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine/Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu210029，China）

ObjectiveTo compare the transfection efficiency of cationic polyethylenimine（PEI）with Lipofectamine 2000TM by using the plasmid DNA encoding vascular endothelial cell growth factor（VEGF165）gene in human embryonic kidney cell line 293T.MethodsPEI of different N/P ratio and Lipofectamine 2000TM were used to deliver the vector containing VEGF165to 293Tcells，respectively.Green fluorescent protein（GFP）gene was inserted into the vector as a report gene.Evaluation of cytoactive was performed by CCK－8assay 24hafter transfection.The cells were observed by fluorescent microscope and the presence of VEGF165in cell supernatant was detected by ELISA 48hafter transfection.The transfection efficiency was calculated and compared.ResultsSimilar cytoactive and best transfection efficiency could be obtained when N/P ratio was 9，the transfection efficiency was around 70%.Furthermore，the presence of VEGF165increased significantly after transfection（P＜0.05），but there was no significant difference between the two groups in which different transfection methods were adopted.ConclusionPEI as a novel oligofectamine reagent could mediate more efficient transfection compared with lipofectamine.It also has low cell－toxicity and low price and could be an ideal vector in gene delivery technology.

polyethylenimine； lipofectamine； gene transfection； transfection efficiency

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.018

A

1673－4130（2015）03－0328－03

2014－12－08）

曹慧玲，女，主管檢驗技師，主要從事醫(yī)學檢驗基礎(chǔ)研究。