董 妍,胡文忠,姜愛麗,馮 可,呂曉萌,紀懿芳

(1.大連工業(yè)大學食品學院,遼寧大連 116034;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024;4.沈陽農業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

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食源性大腸桿菌快速檢測技術研究進展

董 妍1,胡文忠2,*,姜愛麗2,馮 可3,呂曉萌4,紀懿芳1

(1.大連工業(yè)大學食品學院,遼寧大連 116034;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024;4.沈陽農業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

大腸桿菌又稱大腸埃希氏菌(Escherichiacoli),其中有少數血清型可引起食源性疾病,對人類生命健康產生很大危害。因此,研究快速、靈敏、特異的食源性大腸桿菌檢測方法對有效保障食品安全有著重要意義。本文對食源性大腸桿菌快速檢測技術的研究進展進行了綜述。

大腸桿菌,檢測技術,快速

1855年Theodor Escherich首次分離出大腸埃希氏菌,也稱大腸桿菌。大腸桿菌大多數是人或動物腸道中的重要的寄生菌,不具有致病性,但少數大腸桿菌具有致病性,可引起人類疾病。根據生物特性可將其分成五類:腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhageE.coli,EHEC)、腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicE.coli,EPEC)、腸產毒性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveE.coli,EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(EnteroaggregativeE.coli,EAEC)。大腸桿菌在食品衛(wèi)生質量監(jiān)測中可作為指示菌,在環(huán)境衛(wèi)生不良的情況下,大腸桿菌有可能污染農業(yè)用水,繼而污染農產品,造成食品安全疾病的暴發(fā)。

長期以來,我國乃至世界范圍內暴發(fā)的食品安全事件中,有很大比例是由食源性大腸桿菌引發(fā)的。2011年,德國因食用攜帶大腸桿菌O104∶H4的芽菜而暴發(fā)了大腸桿菌疫情;同年美國因食用被大腸桿菌O157∶H7污染的草莓而發(fā)生感染事件;2012年,加拿大暴發(fā)大規(guī)模的大腸桿菌疫情,源頭為牛肉產品;2013年,美國暴發(fā)大規(guī)模大腸桿菌疫情,反映了相關多種食品的加工方面存在嚴重的安全控制缺陷;2014年,蘇格蘭因食用疑似被污染的漢堡發(fā)生大腸桿菌疫情[1]。大腸桿菌不但通過水源、食物傳播而引起人類疾病,而且還會因全球貿易交流給社會經濟帶來風險。由此可見,為保障人類健康和減輕經濟貿易損失,研究開發(fā)準確、快速的食源性大腸桿菌檢測技術是十分必要的。因此,本文從免疫學、分子生物學等方面,對食源性大腸桿菌檢測技術進行了綜述。

1 免疫學檢測技術

1.1 酶聯免疫吸附技術

酶聯免疫吸附技術(ELISA)就是通過抗原和抗體特異性結合,產生顯色反應的有色產物來定性或定量分析。近年來ELISA檢測方法不斷改良,其靈敏度、穩(wěn)定性、檢測速度也在不斷提高,同時,ELISA方法易受待測物質含量、免疫原性、穩(wěn)定性、結構等諸多因素干擾,對試劑選擇性高的問題也不容忽視。Ge[2]等人建立一種方法對大腸桿菌O157∶H7及其他產志賀毒素大腸桿菌進行了檢測,主要是用ELISA方法檢測產志賀毒素大腸桿菌DNA的PCR擴增產物,與普通PCR相比,靈敏度提高100倍,整個過程約6h,應用于碎牛肉的檢測限為105CFU/g。Galikowska[3]等人應用ELISA方法檢測大腸桿菌O157∶H7等多種大腸桿菌,此方法用噬菌體代替了抗體,靈敏度為106cells/mL。

1.2 免疫層析技術

免疫層析技術主要是經毛細管作用,使待測樣品中的抗原或抗體與包被有已知抗原或抗體的微孔濾膜載體結合,通過標記物標記達到定性檢測目的,其特點是方便快速、適用性廣、穩(wěn)定、易于判讀,但其靈敏度有待提高。Park[4]等人應用免疫層析技術對包含大腸桿菌O157∶H7在內的四種菌進行了多重檢測,大腸桿菌O157∶H7的檢測范圍為1.2×105～1.2×107CFU/mL,檢測在20min內完成。Yonekita[5]等人開發(fā)了專用于檢測產志賀毒素大腸桿菌O26的免疫層系試紙條,檢測限為2.2×103～1.0×105CFU/mL,并應用于人工污染的牛肉、蘿卜芽等食物樣本中,經18h増菌后檢出限大約為1CFU/25g,與PCR檢測結果100%一致。CUI[6]等人應用膠體金免疫層析法結合免疫磁珠分離技術快速檢測大腸桿菌O157∶H7,檢測限為7.6×103CFU/mL,將10CFU/g大腸桿菌O157∶H7接種于食品樣本中,檢測時間小于72min。

1.3 量子點熒光探針技術

量子點在受到激發(fā)后具有優(yōu)良的熒光性能,與相關抗體結合可成為特異性熒光探針,再與目標菌免疫結合而形成熒光免疫復合物,通過復合物的熒光強度測定出目標菌的濃度。量子點具有熒光發(fā)射波長可控、量子效率高、光穩(wěn)定性好等特點[7],量子點標記技術具有快速、靈敏的優(yōu)點。Mitchell[8]等人應用量子點標記技術檢測大腸桿菌O157∶H7,檢測限為49×10-15mol/L。Sanvicens[9]等人用量子點標記anti-IgG抗體陣列檢測三明治中的大腸桿菌O157∶H7,未富集樣品的檢測限低于10CFU/mL,比ELISA方法的檢測限提高了三個數量級。

2 分子生物學檢測技術

2.1 常規(guī)PCR

PCR技術是在短時間內對特定DNA序列在體外進行大量擴增。常規(guī)PCR對擴增產物的鑒定主要是通過電泳技術[10],其特點是微量、快速、特異性靈敏性較高,現已被廣泛應用于食源性致病菌的檢測中、但其易產生假陽性結果的問題也不容忽視。Sangdee[11]等人利用腸桿菌基因間重復一致序列(ERIC)設計了SCAR引物來檢測大腸桿菌,能夠檢測50pg的基因組DNA和100CFU/mL的大腸桿菌細胞,具有良好特異性。徐義剛[12]等人設計了一對雙啟動寡核苷酸引物對產腸毒性大腸桿菌進行PCR檢測,檢測靈敏度為1.24×102CFU/mL。

2.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是在反應體系中加入特定的熒光物質,可以對擴增產物進行標記跟蹤,也可以對反應進行實時監(jiān)控,最后根據標準曲線進行檢測分析。與常規(guī)PCR方法相比,熒光定量PCR的特異性和靈敏度較高,操作簡單,具有定量功能。常用的熒光定量PCR方法有染料法[13]和探針法[14]。染料法常用熒光染料如SYBR GreenⅠ,與DNA分子非特異性結合而被染色。探針法是PCR在擴增時,在加入引物的同時加入一個特異性的熒光探針,如TaqMan探針、分子信標、雙雜交探針、復合探針等。染料法操作簡單,而探針法特異性較高。Wang[15]等人針對大腸桿菌和志賀氏菌的tuf基因,確定了通用引物和探針,建立了一種應用擴增內標的雙實時熒光定量PCR方法,以檢測大腸桿菌O157∶H7、大腸桿菌O111∶H8、大腸桿菌O121∶H19、志賀氏菌等多種菌,擴增效率大于96%,并應用此方法檢測人工污染的原料奶,未經預増菌的檢出限為102CFU/mL,經預増菌的每10mL檢出限小于10CFU。Kim[16]等人針對大腸桿菌O157∶H7的eaeA基因設計引物和探針,應用熒光定量PCR檢測鮮切甘藍,増菌后檢出限為1.53logCFU/mL,總時間不超過9h,擴增效率為94.17%。Khatami[17]等人針對大腸桿菌O157∶H7的stx-1基因設計引物和探針,開發(fā)了基于特異性雜交的熒光擴增PCR技術(FLASH-PCR),該技術在PCR擴增結束后將結果轉化為FLASH格式,用以檢測反映熒光強度的熒光信號,擴增產物為336bp,該技術具有特異、簡便、快速、低污染的特點。

2.3 多重PCR

多重PCR可以同時檢測多種目標菌或基因,即在同一反應體系里同時加入多對特異性引物,擴增多條DNA片段。這種方法能夠極大節(jié)省檢測時間、特異敏感、高效簡便。但此技術存在著引物之間相互干擾、體系中易發(fā)生競爭性抑制等問題。Son[18]等人對五種毒力基因stx1、stx2、eae、ehxA、uidA建立了多重PCR方法,應用于人工污染的菠菜,苜蓿芽和香菜中,能夠特異檢測大腸桿菌O157∶H7和產志賀毒素的非O157大腸桿菌,檢測時間約為75min,具有更廣泛的檢測能力。Gordillo[19]等人對大腸桿菌O157∶H7的fliCh7和rfbE基因設計特異性引物和探針,建立了雙重實時PCR并應用于人工污染的肉制品,檢測限為10或102CFU/g,4h増菌后,檢測限降低到約1CFU/g,總時間約8h。Binet[20]等人對番茄、甜椒等六類農產品的志賀氏菌和腸侵襲性大腸桿菌進行了多重PCR檢測,檢測時間小于90min,檢測限1.6×103CFU/mL。

2.4 環(huán)介導等溫擴增

環(huán)介導等溫擴增(LAMP)是一種新型恒溫核酸擴增技術,針對目的基因6個區(qū)域設計4種特異引物,恒溫條件下用鏈置換DNA聚合酶作用15～60min,最終由擴增副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度來鑒定,其特點是簡便、特異性好、靈敏,但由于恒溫條件,無法進行多重擴增,另外還要選擇合適的特異引物及盡量避免反應體系受污染的問題。Wang[21]等人應用LAMP技術檢測原料奶中的大腸桿菌O157,添加了疊氮溴化乙錠來選擇性擴增活菌,檢測限為440CFU/mL,顯著低于添加疊氮溴化乙錠的PCR反應的檢測限(4.4×104CFU/mL)。Wang[22]等人應用LAMP技術檢測萵苣、菠菜中的產志賀毒素大腸桿菌,并模擬了表面染菌和冷藏過程,檢測限為103～104CFU/g,檢測時間10～45min。

2.5 基因芯片

基因芯片技術是將含待測樣品PCR擴增產物的熒光標記探針與芯片上寡核苷酸點雜交,然后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來分析鑒定。Suo[23]等人對基因芯片進行了優(yōu)化,并將其應用于26種包鮮肉樣品中大腸桿菌O157∶H7的檢測和基因分型中,在4種獨立包裝的樣品中分離出三種不同的大腸桿菌O157∶H7。Kim[24]等人建立了分子信標基因芯片體系檢測大腸桿菌O157∶H7,消除了假陰性信號的風險,樣品中目的基因的檢出限可降低到≤1ng/μL。陳昱[25]等人建立一種運用多重 PCR 和基因芯片技術檢測大腸桿菌O157∶H7等三種致病菌的方法,此方法將三重PCR擴增產物與含特異性探針的芯片雜交,基因組DNA的檢測限約為8pg,對于細菌純培養(yǎng)物的檢測限約為50CFU/mL。

3 紅外光譜技術

紅外光譜技術主要測定微生物的傅里葉變換紅外光譜來獲得微生物及其生物大分子結構的信息,由此鑒定微生物種類及狀態(tài)。Siripatrawan[26-27]等人將紅外光譜技術與化學計量學結合以檢測多種大腸桿菌,在其生長期的第4h到第12h,菌數從103CFU/mL增長到1010CFU/mL,并將此法應用于檢測人工污染的不同濃度大腸桿菌的菠菜中,檢測結果為5.1～7.4logCFU/g。路春霞[28]等人利用紅外光譜技術對大腸桿菌O157∶H7等四種食源性致病菌進行了研究,結果表明此方法對四種致病菌具有良好的區(qū)分效果,有望成為一種快速檢測食源性致病菌的新方法。

4 傳感器技術

傳感器技術是將可識別物質的濃度轉換為電信號進行檢測的設備。該技術具有穩(wěn)定、靈敏、快速等優(yōu)點。Li[29]等人采用經二茂鐵-抗菌肽結合物修飾的生物傳感器檢測,其靈敏度達到103CFU/mL,并對比了此傳感器對大腸桿菌O157∶H7、大腸桿菌K12、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的選擇性,發(fā)現其優(yōu)先選擇大腸桿菌O157∶H7。李杜娟[30]等人建立了一種采用電化學阻抗譜技術的生物傳感器,它通過石英晶體金電極表面附著一層蛋白A膜來固定抗體,以達到快速檢測大腸桿菌O157∶H7的目的,檢測限為103CFU/mL,檢測時間少于10min。Chan[31]等人將大腸桿菌O157∶H7與特異性抗體修飾的磁珠偶聯,通過電化學免疫傳感器中的納米多孔膜收集,檢測限為10CFU/mL。

5 其他

現階段大腸桿菌檢測技術隨著科技的深入發(fā)展也得到了極大拓展,更多先進的檢測技術被開發(fā)、應用,同時多技術相互聯用也大大提高了對其的檢測能力。噬菌體檢測技術在檢測食源性致病菌方面具有方便、特異、費用適中等特點;免疫分離技術常與PCR技術聯用以提高實驗靈敏性;PCR技術與ELISA技術結合而成的PCR-EIA技術在靈敏度、特異性等方面有著諸多優(yōu)勢;微生物專用酶快速反應檢測技術利用大腸桿菌相關的特異性酶(β-D-葡糖醛酸糖苷酶)產生的顏色反應以鑒定大腸桿菌,此方法具有簡便、快速、廣泛適用等優(yōu)點。Kim[32]等人應用多酶-納米金顆粒探針檢測大腸桿菌O157∶H7,檢測限為102CFU/mL,檢測時間1h以內。Safavieh[33]等人應用微流控芯片電化學分析方法結合環(huán)介導等溫擴增定量檢測大腸桿菌,檢測時間1h,在LB培養(yǎng)基中檢出菌體為24CFU/mL,檢出DNA為8.6fg/μL。Jothikumar[34]等人應用等溫基因指數性擴增反應檢測大腸桿菌O157∶H7,檢出限為20CFU/reaction。

6 展望

目前,在我國應用于國家檢測標準的是傳統(tǒng)選擇性增菌、生化鑒定的檢測方法,但其在檢測周期及靈敏度方面都有一定局限性,隨著科學技術水平的不斷提高,各種新型檢測技術不斷被開發(fā)應用?；诜肿由飳W的基因檢測技術能夠準確檢測大腸桿菌,并兼具靈敏、快速的特點,成為研究熱點。對未經前增菌過程的大腸桿菌進行定量檢測,能夠提高檢測的準確性及速度,這就給檢測技術的靈敏度提出了更高的要求,同時也將是今后研究的熱點之一。另外,五種致病大腸桿菌的毒力基因、發(fā)病機制、疾病表現形式也不盡相同,研究針對不同類型致病大腸桿菌的檢測技術對有效保障食品安全有著重要意義,這就需要更多的依賴基因水平的研究。為有效預防食源性致病菌感染,就要建立準確、快速的檢測體系來保障食品安全,雖然現階段對大腸桿菌檢測方法的研究已比較深入,并具有多層次、多角度的特點,但快速、特異、靈敏仍是大腸桿菌檢測技術面臨的重大課題,由此可見,食源性大腸桿菌檢測技術仍有廣闊的開拓空間。

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Research progress in rapid detection for foodborneEscherichiacoli

DONG Yan1,HU Wen-zhong2,*,JIANG Ai-li2,FENG Ke3,LV Xiao-meng4,JI Yi-fang1

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China;4.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Escherichiacoliis known asE.coli. A few serotypes ofE.colican cause foodborne diseases. It’s harmful to human health. Therefore,it’s significant for establishing the rapid,sensitive and specific detection method of foodborneE.colito guarantee the food safety. In this paper,the research development of rapid detection technologies on foodborneE.coliin food was summarized.

Escherichiacoli;detection technologies;rapid

2014-05-13

董妍(1989-),女,在讀碩士,研究方向:食品安全。

*通訊作者:胡文忠(1959-),男,博士，教授,研究方向:食品科學。

國家自然科學基金項目(31172009)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)；大連科技計劃項目(2012E13SF106)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)05-0384-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.073