朱丹 蔡可英 曹萌 劉超

胰島素原穩(wěn)態(tài)與胰島β細(xì)胞功能

朱丹 蔡可英 曹萌 劉超

胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有大量新合成的胰島素及胰島素前體即胰島素原，胰島素原經(jīng)過(guò)正確的處理轉(zhuǎn)換為天然折疊單體形式即有活性的胰島素原，后者經(jīng)過(guò)剪切去除C肽而形成胰島素，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。未折疊或者錯(cuò)誤折疊的胰島素原則仍以非天然折疊多肽的形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。任何原因?qū)е碌囊葝u素原折疊率的改變均會(huì)導(dǎo)致胰島素原穩(wěn)態(tài)失衡,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島β細(xì)胞的功能改變。

胰島素原；胰島β細(xì)胞；糖尿病；胰島素原穩(wěn)態(tài)

眾所周知，2型糖尿病發(fā)病的重要機(jī)制是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭。研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病發(fā)病之前就有胰島素抵抗的長(zhǎng)期存在。但并不是所有胰島素抵抗均會(huì)發(fā)展為糖尿病，因?yàn)榇藭r(shí)的胰島β細(xì)胞還可以產(chǎn)生過(guò)量的胰島素來(lái)代償胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，遺傳缺陷、缺氧、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變等均可擾亂胰島素的合成和分泌過(guò)程，抑制胰島素基因的表達(dá)，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的凋亡等，進(jìn)而導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生[1]。可見(jiàn)，胰島β細(xì)胞功能衰竭是糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。

1 胰島素原合成及胰島素原穩(wěn)態(tài)（PIHO）

正常條件下，前胰島素原在信號(hào)肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號(hào)系統(tǒng)相互作用，被協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中。轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的前胰島素原的信號(hào)肽被裂解后形成胰島素原，新合成的胰島素原必須在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊才能轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體被包裹成分泌顆粒，進(jìn)而在其中轉(zhuǎn)化為有生物活性的胰島素[2]。任何原因?qū)е碌囊葝u素原錯(cuò)誤折疊均可使之在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能失調(diào)[3]。PIHO失衡是指胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素原天然折疊單體與非天然折疊多肽比例失調(diào)所致胰島素釋放異常、胰島β細(xì)胞功能衰竭[4]。

胰島素原在轉(zhuǎn)換為胰島素的過(guò)程中，通過(guò)正確折疊形成天然胰島素單體，是形成胰島素雙鏈結(jié)構(gòu)的先決條件。但是若錯(cuò)誤折疊，則形成的胰島素原由于空間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，無(wú)法組裝成有活性的胰島素[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素原天然折疊率在糖尿病的發(fā)病中起重要作用。Wang等[4]發(fā)現(xiàn)，正常小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素原的天然折疊單體約占70%，非天然折疊多肽占30%，而糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素原的天然折疊單體僅占10%，非天然折疊多肽占90%。說(shuō)明胰島素原折疊率決定了胰島素釋放的效率，胰島素原的自身成熟及轉(zhuǎn)化可能是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡。

正常條件下，胰島β細(xì)胞會(huì)形成少量錯(cuò)誤折疊的胰島素原。這些胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊相關(guān)蛋白或分子伴侶的幫助下，可再折疊成空間構(gòu)型正常的胰島素原，而不能再次正確折疊的胰島素原則通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解系統(tǒng)被降解。因此，少量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)并不影響正常胰島β細(xì)胞的功能[6]。即在正常條件下，胰島素原的折疊率是可以保持在正常范圍內(nèi)的，被稱(chēng)為PIHO[7]。持久或劇烈的ERS會(huì)引起胰島β細(xì)胞功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。

2 PIHO失衡的發(fā)現(xiàn)

在體外生物工程制造胰島素類(lèi)似物治療糖尿病時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了異常的胰島素原二硫化物異構(gòu)體，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在生理?xiàng)l件下β細(xì)胞會(huì)形成少量錯(cuò)誤折疊的胰島素原[9-10]。在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊相關(guān)酶及分子伴侶的幫助下，錯(cuò)誤折疊的胰島素原可再折疊形成正常的空間構(gòu)型，而不能再次正確折疊者，將被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解系統(tǒng)降解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其原因?yàn)橐葝u素原二硫鍵不能正確配對(duì)，導(dǎo)致胰島素原不能正確折疊生成有活性的胰島素原，使異常且錯(cuò)誤折疊的胰島素原增多[11]。單胰島素基因C（A7）Y突變的糖尿病小鼠即Akita小鼠模型已廣泛用于對(duì)糖尿病的研究，其特征是胰島β細(xì)胞明顯受損而不伴有胰島素抵抗[12]。通過(guò)對(duì)Akita小鼠的研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)存在胰島素原失衡。Yuan等[13]對(duì)Akita鼠及相關(guān)的胰島細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平未見(jiàn)明顯異常，而在翻譯后加工過(guò)程發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤折疊的胰島素原堆積、胰島素分泌明顯減少。這一現(xiàn)象在非肥胖小鼠模型中也同樣存在，提示胰島素原形成胰島素的過(guò)程存在異常，錯(cuò)誤折疊的胰島素原滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不能被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體及下游的分泌通路，胰島素合成減少并激活ERS，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡。

現(xiàn)有資料表明，PIHO失衡對(duì)胰島β細(xì)胞的影響主要有兩個(gè)方面。首先，它可以導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在電子顯微鏡下，與正常小鼠胰島β細(xì)胞相比，Akita小鼠胰島β細(xì)胞成熟胰島素顆粒明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及線粒體不同程度擴(kuò)張，溶酶體數(shù)量增多[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)，Akita小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些類(lèi)似豆莢樣的結(jié)構(gòu)，猜測(cè)可能是未成熟的胰島素顆粒[13]。其次，它可以導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生ERS。研究顯示，Akita鼠體內(nèi)ERS標(biāo)志物如轉(zhuǎn)錄活化因子6、X-結(jié)合蛋白1的表達(dá)明顯增加[15]。ERS誘導(dǎo)的CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）表達(dá)增加，可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Akita小鼠糖尿病的發(fā)生，而敲除CHOP基因的小鼠，ERS誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡減少，糖尿病的發(fā)生延遲[16]。以上研究均說(shuō)明Akita鼠發(fā)生糖尿病主要是由于錯(cuò)誤折疊或未折疊的胰島素原堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)致PIHO失衡，進(jìn)而引起ERS，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡。

3 PIHO的機(jī)制

3.1 胰島素原過(guò)度合成導(dǎo)致PIHO失衡 有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病發(fā)生之前，胰島素抵抗已長(zhǎng)期存在，為了代償其所引起的胰島素分泌相對(duì)不足，胰島β細(xì)胞代償性合成超過(guò)其折疊能力的胰島素原，致使錯(cuò)誤折疊或未折疊的胰島素原顯著增加[17]。對(duì)Akita小鼠β細(xì)胞中胰島素原合成、折疊及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，盡管β細(xì)胞分泌的胰島素的量明顯減少，但新合成的胰島素原的量并未減少（包括正確折疊和錯(cuò)誤折疊的胰島素原）[18]。細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的胰島素原增多，其可能是突變的胰島素基因與未突變的基因相互作用，影響胰島素原的正確合成和折疊，并阻斷其轉(zhuǎn)運(yùn)、加工及分泌，進(jìn)一步加重胰島素的缺乏。其具體的分子機(jī)制尚須更深入的研究。但胰島素原天然折疊率的比例發(fā)生改變，誘導(dǎo)了PIHO失衡。

3.2 胰島素合成相關(guān)的基因突變導(dǎo)致PIHO失衡正常小鼠體內(nèi)有2對(duì)有功能、不等位的胰島素基因即INS1和INS2。來(lái)自胰島素基因敲除的研究證實(shí)，小鼠擁有一半以上的正常胰島素基因就可避免發(fā)生糖尿病[19]。Akita小鼠有4條胰島素合成相關(guān)的基因，其中1條基因INS2發(fā)生突變時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其不影響INS1、INS2的轉(zhuǎn)錄水平，理論上胰島β細(xì)胞功能尚可維持。然而，進(jìn)一步對(duì)Akita小鼠的研究卻發(fā)現(xiàn)，3.5到4周齡時(shí)小鼠就發(fā)生了嚴(yán)重的胰島素缺乏[14，20]。這提示胰島素基因突變的毒性作用被放大了，其發(fā)病病因并非由于喪失了1條正常的胰島素基因，可能還有其他機(jī)制存在。通過(guò)對(duì)Akita小鼠的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，INS2基因突變導(dǎo)致胰島素第96位表達(dá)半胱氨酸的基因被酪氨酸取代，胰島素A鏈、B鏈之間的二硫鍵形成受阻，無(wú)法形成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，引發(fā)持續(xù)的ERS，最終引起胰島β細(xì)胞功能失調(diào)[21]。

目前研究證實(shí)，很多與糖尿病有關(guān)的胰島素基因突變都是通過(guò)引發(fā)胰島素原的錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致ERS，使胰島素合成減少。其中一些胰島素基因突變是通過(guò)改變胰島素原肽鏈上的半胱氨酸的數(shù)量，導(dǎo)致半胱氨酸殘基變成奇數(shù)，破壞胰島素原分子內(nèi)部二硫鍵的正確形成，或因游離的半胱氨酸與未突變的胰島素原分子上的二硫鍵異常配對(duì)，導(dǎo)致胰島素原的錯(cuò)誤折疊，進(jìn)而引發(fā)ERS[22]。

3.3 分子伴侶表達(dá)量的改變導(dǎo)致PIHO失衡 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，前胰島素原被裂解成信號(hào)肽和胰島素原，后者在分子伴侶的幫助下正確折疊，繼而轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，進(jìn)入未成熟的分泌顆粒。在未成熟的顆粒中胰島素原在蛋白水解酶的作用下除去C肽生成成熟的胰島素并儲(chǔ)存在成熟的分泌微粒中。

G蛋白耦聯(lián)受體（GRP）78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶之一，其利用ATP水解的能量加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊并阻止其堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。正常生理?xiàng)l件下，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3個(gè)跨膜蛋白（蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、肌醇激酶1活化轉(zhuǎn)錄因子6）結(jié)合形成復(fù)合物使它們不能被磷酸化活化，處于非激活狀態(tài)[23]。這3個(gè)跨膜蛋白已被確定為ERS的感應(yīng)蛋白，其磷酸化后可誘發(fā)ERS。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的胰島素原增多時(shí)，其首先與GRP78結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性干擾GRP78與3個(gè)跨膜蛋白結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)跨膜蛋白的解離釋放并通過(guò)一系列反應(yīng)發(fā)生磷酸化活化，誘發(fā)ERS[24]。ERS是細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制，適度的ERS可使細(xì)胞在外界刺激下恢復(fù)穩(wěn)定，維持生存，但持續(xù)的ERS可導(dǎo)致胰島細(xì)胞凋亡[25]。

GRP78一方面通過(guò)參與未折疊蛋白的正確折疊、修飾來(lái)保護(hù)細(xì)胞，另一方面還可以與鈣離子結(jié)合保持鈣離子平衡以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[26]。正常組織中，GRP78的表達(dá)水平較低，在缺血、缺氧、鈣離子失衡等應(yīng)激環(huán)境下，其表達(dá)明顯增加，協(xié)助蛋白質(zhì)進(jìn)行重新裝配和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，保護(hù)細(xì)胞。但當(dāng)持續(xù)或嚴(yán)重的ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡不能恢復(fù)時(shí)，細(xì)胞將啟動(dòng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡程序。所以，GRP78的表達(dá)量反映了細(xì)胞損傷情況和應(yīng)激能力，對(duì)決定細(xì)胞的生存狀態(tài)有重要的作用。對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)初期，GRP78的表達(dá)量增加，以保護(hù)細(xì)胞，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，GRP78的表達(dá)量明顯下降，未折疊及錯(cuò)誤折疊的胰島素原增多[27]。除GRP78外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶P58也參與了蛋白質(zhì)的折疊。敲除P58基因的小鼠，其胰島β細(xì)胞功能的紊亂，胰島素分泌減少[28]。

綜上所述，PIHO失衡導(dǎo)致嚴(yán)重的ERS、葡萄糖刺激的胰島素分泌減少以及胰島β細(xì)胞存活率降低。因此，任何原因?qū)е碌腜IHO失衡均可能引起胰島β細(xì)胞功能失調(diào)、血糖調(diào)節(jié)受損，從而引發(fā)糖尿病的發(fā)生。通過(guò)對(duì)PIHO的研究，可以發(fā)現(xiàn)治療糖尿病的新靶點(diǎn)，為臨床盡早診斷和治療糖尿病提供了一個(gè)新的思路，值得深入研究。但目前對(duì)于胰島素原的研究都是基于鼠源性胰島β細(xì)胞，其與人胰島β細(xì)胞在形態(tài)及功能等方面具有很大區(qū)別，因此，鼠源性胰島β細(xì)胞并不是研究人類(lèi)糖尿病發(fā)病機(jī)制的理想模型，故需要開(kāi)展基于人胰島β細(xì)胞平臺(tái)的研究。

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Proinsulin homeostasis and islet β cell function

Zhu Dan*，Cai Keying，Cao Meng，Liu Chao.*Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China

Cai Keying，Email：caikeying@medmail.com.cn

There is a large number of newly synthetic insulin and proinsulin in endoplasmic reticulum of islet β cells.If correctly folded，proinsulin can be converted into native folded monomeric proinsulin with activity.Unfolded ormisfolded non-nativeformofproinsulin willbe preserved in the endoplasmic reticulum as the folded polypeptide.Changes of proinsulin folding rate caused by any reasons will result in the imbalance ofproinsulin homeostasis，endoplasmic reticulumstress and islet β cells dysfunction.

Proinsulin；Islet β cell；Diabetes mellitus；Proinsulin homeostasis

（Int J Endocrinol Metab，2015，35：110-113）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.02.010

221004 徐州醫(yī)學(xué)院（朱丹）；221006 徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（蔡可英）；210028 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病院區(qū)（曹萌，劉超）

蔡可英，Email:caikeying@medmail.com.cn

2014-11-16）