白濟(jì)豪

(哈爾濱市動(dòng)物衛(wèi)生防疫站，黑龍江 哈爾濱150016)

1 稀釋液與冷凍保護(hù)劑

近30年來(lái)人們研制了各種豬的凍精稀釋液。一般來(lái)說(shuō)，各種稀釋液都含有糖、蛋白和脂蛋白、緩沖液、添加劑及冷凍保護(hù)劑。根據(jù)其成分可以分為兩大類: 第一類是不含緩沖液的稀釋液，例如卵黃 葡萄糖、卵黃 乳糖、卵黃 蔗糖-EDTA-Mg-Ca 溶液; 第二類為含緩沖液的稀釋液，例如氨基乙酸 磷酸鹽和葡萄糖 磷酸鹽、卵黃 葡萄糖 檸檬酸、Beltsville F3 (BF3) 、Beltsvle F5(BF5) 、Tes- tris 果糖 檸檬酸 卵黃(TEST) 、Tes- NaK 果糖 卵黃、Tris 果糖 EDTA 卵黃、Tris 果糖 EDTA 卵黃等。

如果進(jìn)行兩步稀釋時(shí)，含甘油的稀釋液可在將精液降溫到5℃時(shí)加入。

稀釋液的成分雖然差別很大，但其共有的特點(diǎn)是甘油濃度低，平衡時(shí)間短。甘油與精子接觸時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)精子經(jīng)受冷凍解凍的能力沒(méi)有明顯影響。目前，大多是在冷凍前任何時(shí)間均可加入甘油，加入后甘油能很快被吸收而進(jìn)入精子。

雖然人們對(duì)許多冷凍保護(hù)劑的效果進(jìn)行了研究，但對(duì)豬的精子而言仍以甘油的效果最好。其他效果較好的保護(hù)劑還有木糖醇、核糖醇、乙酰胺和DMSO，這些物質(zhì)在濃度較低時(shí)能提高精子解凍后的活力，但頂體完整的精子數(shù)減少。因此，目前甘油仍是豬冷凍精液最常用的冷凍保護(hù)劑。只是豬精子對(duì)甘油最為敏感，其在冷凍保存豬精子時(shí)的最佳濃度受許多因素的影響，例如冷凍速度等。一般情況下，甘油的濃度均較低，如果濃度過(guò)高，雖然能有效保護(hù)精子，但精子的受精能力會(huì)降低，也會(huì)損傷頂體膜，改變膜的通透性。

2 降溫速度及其與甘油濃度的關(guān)系

目前冷凍豬精液的方法基本有兩種，即Beltsville 法和Westendorf 法。前者是將富含精子的部分采集后與精清持留2 h，然后離心，降溫3 h后在干冰上制成0.15 ～0.20 mL 的顆粒凍精。后一種方法是將精液按1∶2 稀釋，然后在Hulsenberg 8稀釋液中降溫，最后制備成細(xì)管凍精。后來(lái)，人們根據(jù)研究結(jié)果對(duì)細(xì)管凍精進(jìn)行了改進(jìn)，如2 mL 的細(xì)管凍精、5 mL 的塑料袋等劑型，但在生產(chǎn)中仍未能廣泛普及。

甘油的冷凍保護(hù)效果受許多因素的影響。其一是降溫速度。當(dāng)含精子的懸浮液降溫到溶液的冰點(diǎn)以下時(shí)，精子和溶劑會(huì)出現(xiàn)超冷，最后形成冰晶，當(dāng)膜系統(tǒng)阻止冰晶膨脹時(shí)精子內(nèi)容物并未冷凍。隨著溫度的降低，超冷的細(xì)胞水分對(duì)增加的滲透壓發(fā)生反應(yīng)，擴(kuò)散出細(xì)胞而結(jié)凍。外滲的速度受細(xì)胞膜通透性的影響，特別是膜對(duì)水分和甘油通透性的影響，也受細(xì)胞大小和細(xì)胞表面積比例的影響。這種影響在一定程度上可以通過(guò)調(diào)節(jié)冷凍速度和冷凍保護(hù)劑濃度得到改善，如果冷凍速度很慢，則精子通過(guò)脫水而避免了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。如果精子冷凍過(guò)快，則細(xì)胞內(nèi)的水分因不能外滲而結(jié)冰。根據(jù)這種雙因素理論，精子細(xì)胞受損主要來(lái)自兩個(gè)方面: 其一是由于冷凍速度不適宜而引起脫水，這稱為溶液效應(yīng)，主要是由于細(xì)胞與高濃度的溶劑發(fā)生反應(yīng)，因此pH 發(fā)生變化; 其二是由于精子冷凍過(guò)快而引起細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。

對(duì)甘油濃度和冷凍速度對(duì)精子活力的影響進(jìn)行的研究表明，如果降低甘油濃度則應(yīng)加速冷凍速度。就精子活力而言，最佳甘油濃度為3% ～4%，對(duì)最佳的頂體完整性(NAR) 而言，最佳濃度為0 ～1%。對(duì)這兩個(gè)參數(shù)而言，最佳的冷凍速度為30℃/min。據(jù)此有人建議，冷凍豬精子時(shí)甘油濃度為3%，冷凍速度為30℃/min。甘油濃度超過(guò)6%時(shí)會(huì)明顯引起頂體損傷，這種作用可能是由于化學(xué)毒性或滲透壓變化所引起。

快速冷凍過(guò)程中精子質(zhì)膜脂類的組成及組織也會(huì)發(fā)生明顯的改變，可使膜的通透性增加。許多研究表明，冷凍解凍的精子會(huì)出現(xiàn)類似于獲能的變化，精子通過(guò)流式細(xì)胞儀篩選時(shí)也會(huì)出現(xiàn)這些變化。

3 解凍

通過(guò)關(guān)鍵溫區(qū)解凍精子的速度是影響精子存活的另一個(gè)極為重要的因素。盡管制成細(xì)管凍精的越來(lái)越多，但豬的精液大多數(shù)是在干冰上制成顆粒凍精。顆粒凍精一般在預(yù)熱的溶液中解凍時(shí)由于加熱速度快，因此效果較好。解凍效果與冷凍速度有密切關(guān)系，對(duì)精子的存活有顯著的影響。如果冷凍速度適宜，則隨著解凍速度的加快，精子活力和頂體完整率增加?？焖俳鈨鲱w粒凍精時(shí)效果也很好，說(shuō)明精子快速冷凍后的冷凍損傷主要是由于慢速解凍時(shí)小冰晶向外生長(zhǎng)所引起。解凍速度對(duì)頂體完整率的影響也受甘油濃度的影響，濃度高時(shí)對(duì)頂體的完整性影響更大。目前的研究表明，要獲得最高的活力和頂體完整率，豬精液冷凍稀釋液的甘油濃度應(yīng)為3%，在0℃ ～- 50℃時(shí)的冷凍速度應(yīng)該為30℃/min，解凍速度為1 200℃/min。

快速解凍時(shí)的最終溫度對(duì)精子的存活也有明顯影響，如果豬的精子在5 ～37℃快速解凍，會(huì)損傷頂體質(zhì)膜，但不會(huì)引起酶的外瀉及降低精子活力，這種所謂的“熱休克”也受溫度范圍的影響。

4 冷凍精液的輸精效果

20 世紀(jì)70年代以前大多采用手術(shù)方法將精液輸入到輸卵管，因此效果較差。1971年才通過(guò)子宮頸輸入凍精獲得產(chǎn)仔。目前的研究表明，冷凍精液的產(chǎn)仔率可達(dá)到50%，每窩可產(chǎn)7 仔。荷蘭對(duì)顆粒凍精一次輸精和鮮精一次輸精效果進(jìn)行比較，其產(chǎn)仔率和窩產(chǎn)仔數(shù)分別為47%、7.4 和79%、10.6，而且結(jié)果在品種間還有明顯差別。研究結(jié)果顯示，顆粒凍精和細(xì)管凍精的產(chǎn)仔率和窩產(chǎn)仔數(shù)分別為55%、8.3 和58%、9.0。目前在采用凍精輸精時(shí)，第1 次是在檢查到發(fā)情后30 h，第2 次是在10 ～12 h 之后。