王素梅，張淑娟，王艷輝，時(shí)廣明，白彩霞，秦光彪，劉玉峰，陳曉華

(1.黑龍江職業(yè)學(xué)院，雙城150111; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，哈爾濱150086)

人工授精(AI) 是使用器械采集公畜的精液，再用器械把經(jīng)過檢查和處理后的精液輸入到母畜生殖道內(nèi)，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一種繁殖技術(shù)，被稱為家畜繁殖領(lǐng)域的第一次革命。精液冷凍保存是人工授精技術(shù)的一項(xiàng)重大革新，它解決了精液長期保存的問題，使精液不受時(shí)間、地域和種畜生命的限制，它是推動(dòng)AI 技術(shù)快速發(fā)展的重要?jiǎng)恿ΑＳ绊懭鋬鼍喝斯な诰Ч囊蛩乇姸啵?］。本試驗(yàn)旨在通過雜種寵物犬精液冷凍過程中稀釋操作和不同劑型間犬凍精冷凍效果的影響，以便為以后國內(nèi)相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器材

隨機(jī)挑選6 只雜種寵物公犬分成A、B 兩組。要求犬只健康、性欲強(qiáng)、性情溫順、無傷人史，年齡在2 ～8 歲。每日飼喂牡丹江新中旭狐貉全價(jià)配合飼料，每天定時(shí)、定量由固定飼養(yǎng)員飼喂，自由飲水。采精期間每天適當(dāng)補(bǔ)充蛋白質(zhì)，同時(shí)每只公犬每天補(bǔ)飼雞蛋一枚。

試劑及儀器: 果糖、Tris(三羥基甲基甲烷) 、檸檬酸鈉、卵黃、甘油、青霉素、鏈霉素。犬用集精杯、溫度計(jì)、漏斗、天平、消毒鍋、細(xì)管、光學(xué)顯微鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精液采集

采用手握法進(jìn)行采精。采精前對(duì)公犬進(jìn)行調(diào)教1 周，使其熟悉采精環(huán)境，安排在每天早、晚進(jìn)行，使公犬形成穩(wěn)定的條件反射。采精時(shí)，在同一時(shí)間、同一地點(diǎn)，均采用手握法進(jìn)行采精。每天每只犬采集1 次精液，然后分為兩份。

1.2.2 精液處理

采精后，立即對(duì)精液進(jìn)行常規(guī)檢查，包括精液顏色、氣味、精液量、精子活力、密度、畸形率、頂體完整率等項(xiàng)目。精子活力采用十級(jí)評(píng)分制，其余操作正常進(jìn)行。檢查后，按設(shè)計(jì)要求進(jìn)行稀釋、分裝和保存處理。

1.2.3 精液稀釋液配方確定及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)國內(nèi)外進(jìn)行犬精液冷凍研究中應(yīng)用最廣泛的稀釋液配方，以凍精的解凍后精子活力作為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)及禹學(xué)禮等實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合自己的一些改進(jìn)，確定犬精液冷凍稀釋液為Tris-果糖稀釋液。配方分為兩部分，分別是I 液和II 液。其中I 液包括Tris 3.025g，果糖1.7 g，檸檬酸鈉1.36 g，甘油3 mL，雙蒸水100 mL; II 液包括Ⅰ液76 mL，卵黃20 mL，甘油5 mL，青霉素1 000 IU/mL，鏈霉素1 000 μg/mL。

本試驗(yàn)中對(duì)采集的新鮮精液進(jìn)行品質(zhì)檢查后，分別用事先配制好的Tris-果糖稀釋液采用一步稀釋法和兩步稀釋法均按照1∶2 倍進(jìn)行稀釋。兩種稀釋方法均采用降溫2 h 至4℃，再平衡2 h 的方法進(jìn)行。一步稀釋法和兩步稀釋法的細(xì)管精液均在平衡后通過自制恒溫設(shè)施下進(jìn)行分裝，然后通過熏蒸法進(jìn)行顆粒凍精以及細(xì)管凍精的凍結(jié)。樣品凍結(jié)面距離液氮面高度為1.0 cm，停留5 min，然后待精液凍結(jié)后，迅速將精液移入液氮中。

本實(shí)驗(yàn)以雜種寵物犬精液的精子活力作為評(píng)定指標(biāo)，用兩種精液稀釋法冷凍犬精液，分別比較三種冷凍方式下精液冷凍前后精子活力的優(yōu)劣，以探索常規(guī)方式下寵物犬精液冷凍程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一稀釋法不同劑型冷凍效果比較

經(jīng)SPSS 檢驗(yàn)，采用一步稀釋法的顆粒凍精的解凍后活力(0.37 ±0.01) 與0.25 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.35 ±0.01) 和0.5 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.32 ±0.01) 的差異均顯著(P ＜0.05) ，而0.25 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.35 ±0.01)與0.5 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.32 ±0.01) 的差異極顯著(P ＜0.01) ，這與禹學(xué)禮等［1］試驗(yàn)結(jié)果基本一致; 采用兩步稀釋法的顆粒凍精的解凍后活力(0.40 ±0.01) 與0.25 mL 細(xì)管凍精的解凍后活力(0.39 ±0.01) 以及0.5 mL 細(xì)管凍精的解凍后精子活力(0.36 ±0.02) 的差異均不顯著(P ＞0.05)(見表1) 。

表1 同一稀釋法不同劑型解凍后精子活力效果比較

2.2 不同稀釋方法精液冷凍效果比較

經(jīng)SPSS 檢驗(yàn)，顆粒凍精采用一步稀釋法的解凍后精子活力(0.37 ±0.01) 與采用兩步稀釋法的解凍后精子活力(0.40 ±0.01) 差異不顯著(P ＞0.05) ; 0.25 mL 細(xì)管凍精采用一步稀釋法的解凍后精子活力(0.35 ±0.01) 與采用兩步稀釋法的解凍后精子活力(0.39 ±0.01) 差異顯著(P ＜0.05) ;0.5 mL 細(xì)管凍精采用一步稀釋法的解凍后精子活力(0.32 ±0.01) 與采用兩步稀釋法的解凍后精子活力(0.36 ± 0.02) 差異不顯著(P ＞0.05) (見表2) 。

表2 不同稀釋方法冷凍精液劑型解凍后精子活力比較

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，雜種寵物犬精液冷凍保存時(shí)采用一步稀釋法顆粒凍精的冷凍效果比0.25 mL 細(xì)管和0.5 mL 細(xì)管均好，而兩步稀釋法對(duì)不同凍精劑型的影響不明顯。

因此，可以考慮以后對(duì)犬精液進(jìn)行冷凍均采用兩步稀釋法，這與Pena A.等的研究發(fā)現(xiàn)先用含低濃度甘油(3%) 稀釋液稀釋精子，再用含高濃度甘油(7%) 稀釋液等倍稀釋后的精液在解凍后質(zhì)量更佳的研究結(jié)果相一致［2］。

［1］禹學(xué)禮，龐有志.犬精液冷凍與人工授精的進(jìn)展［J］.洛陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，1999，6.

［2］Pena A，Linde-Forsberg C.Effects of Equex，one or two stip dilution，and two freezing and trawing rates on post- thaw survival of dog spermatoa ［J］.Theriogenology，2000，54: 859 ～875.