靳興濤，王惠娥 ，繆增強，蘇勇華

(塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300)

卵泡發(fā)育是一個以形態(tài)變化為特征的動態(tài)生長過程，同時伴有卵泡功能的分化。原始卵泡經(jīng)過發(fā)育和分化可形成優(yōu)勢卵泡，使卵子成熟并排出，也可中途閉鎖［1］。抑制素是下丘腦 垂體 性腺軸調(diào)控系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)激素，對卵泡的正常生長、分化及閉鎖起到刺激或抑制作用。抑制素對FSH 具有調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被許多研究所證實，但它作用機制目前尚有爭議。

抑制素(Inhibin，INH) 是雄性動物的睪丸支持細胞C 和雌性動物的卵巢顆粒細胞所分泌的二聚體糖蛋白激素。抑制素基因由α 亞基和β 亞基通過二硫鍵連接而成，β 亞基包括βA 和βB 兩種形式，α 亞基分別與這兩種亞基結(jié)合形成INHA 和INHB［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)，在動物胚胎期、新生動物卵巢及成年雌性動物卵巢中均可以檢測到抑制素亞基基因的表達，但抑制素的不同亞基基因表達的具體時間和表達量在不同物種中存在著很大的差異［4］。Robertson DM［5］等認為，抑制素可以阻斷促性腺激素釋放激素(GnRH) 受體的合成，也可作為GnRH的阻滯劑，主要阻斷了GnRH 受體后水平的信息傳遞，從而降低了細胞對GnRH 的反應(yīng)性。而Bicsak［6］等認為，抑制素可直接通過調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性來影響垂體FSH 合成。許多試驗證明，用不同類型的抑制素免疫原免疫動物，均可引起血FSH 水平增加，而對黃體化激素LH 沒有直接作用，被免疫動物循環(huán)LH 水平無明顯變化。但也有體外試驗表明，豬抑制素制備物可加強綿羊垂體細胞GnRH 誘導(dǎo)的LH 釋放，而抑制素對GnRH 誘發(fā)的鼠垂體細胞FSH 和LH 釋放均表現(xiàn)為抑制作用。這說明抑制素對LH 的作用可能存在種間差異。

本研究擬針對上述實際存在的問題，對新疆多浪羊和卡拉庫爾羊兩個地方品種利用免疫組織化學(xué)法進行卵巢上INHA 的特異性免疫組織化學(xué)染色分析，希望從中發(fā)現(xiàn)它們的某些分布變化規(guī)律，從而為有針對性地建立不同地方綿羊品種的卵泡發(fā)育體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

在新疆喀什莎車縣，選取健康、發(fā)育良好的未孕雌性多浪羊和卡拉庫爾羊各10 只，2 ～3 歲。屠宰后取卵巢組織，置于4%甲醛固定液中。

1.2 主要試劑

兔抗INHA 抗體，抗兔SP 免疫試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。國產(chǎn)分析純有磷酸緩沖液(PBS) 、加拿大樹脂、檸檬酸緩沖液自配。

1.3 切片標本制備

甲醛固定好的卵巢組織修正后梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度6～8 μm。

1.4 INHA 免疫組織化學(xué)染色程序

參考王惠娥文獻［7，8］。

1.5 圖像分析

每樣本分別選取5 張陽性切片，并隨機觀察每張片子的5 個視野，用image J 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計數(shù)各級卵泡免疫組化陽性細胞率(陽性細胞面積/總細胞面積) 的均值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用軟件SPSS 12.0 進行數(shù)據(jù)處理，利用單因子方差分析進行結(jié)果的差異顯著性檢驗并進行多重比較，數(shù)據(jù)相關(guān)分析均為平均數(shù)±標準誤。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下的染色結(jié)果

圖1 抑制素A 在各級卵泡免疫組化定位

2.2 綿羊卵巢中抑制素的定位分布

由圖1 可以看出，免疫組化染色陽性切片背景無色或淡藍色，抑制素A 免疫反應(yīng)細胞為黃色或棕黃色; 陽性細胞的胞質(zhì)中著有黃色或棕黃色反應(yīng)顆粒，蘇木素染成細胞核為淡藍色或藍色。對照組切片染色陰性，背景無色或淡藍色，無黃色或棕黃色染色，說明免疫組化SP 法分別具有抑制素A 免疫反應(yīng)的特異性。

2.3 卵巢中抑制素免疫反應(yīng)物質(zhì)的分布和圖像分析

光鏡下觀察抑制素A 陽性細胞主要分布在膜細胞和卵泡旁血管周圍間質(zhì)中。原始卵泡開始就有抑制素A 陽性物質(zhì)，初級卵泡單層高柱狀的顆粒細胞胞質(zhì)中可見陽性反應(yīng)。隨著卵泡的發(fā)育，卵泡膜細胞分化出來后即呈現(xiàn)較高的染色強度，其與卵泡體積大小無關(guān)。初級卵泡和次級卵泡陽性細胞數(shù)量顯著高于原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。

表1 卵泡抑制素A 陽性細胞圖像分析

表2 各級卵泡抑制素A 陽性細胞染色強度

由表1 可見，卡拉庫爾羊和多浪羊抑制素A陽性細胞在卵泡發(fā)育各階段以及成熟卵泡的膜細胞和血管周圍間質(zhì)都有表達。初級卵泡和次級卵泡中除了膜細胞和血管周圍間質(zhì)表達抑制素A 陽性外，卵母細胞也有表達，且隨著卵泡的增大，陽性細胞表達率呈先遞增后遞減趨勢?？ɡ瓗鞝栄蚝投嗬搜虺跫?、次級卵泡抑制素A 陽性表達率顯著高于原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。兩品種間比較，多浪羊各級卵泡抑制素A 陽性細胞數(shù)均比卡拉庫爾羊高，但差異不顯著(P ＞0.05) 。

由表2 可見，隨卵泡體積增大，陽性膜細胞數(shù)量增多，卵泡腔出現(xiàn)并逐漸增大至大腔階段。膜細胞著色強度增強至腔前卵泡隨后減弱，卵母細胞和顆粒細胞著色強度變化不明顯，細胞間質(zhì)可見陽性染色強度。

3 討論

3.1 抑制素在綿羊卵巢中的定位研究

目前國內(nèi)外有關(guān)綿羊抑制素的研究，主要側(cè)重編碼其各自相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)變化，而利用免疫組化技術(shù)檢測其各自相應(yīng)蛋白產(chǎn)物表達變化的報道相對較少。本實驗結(jié)果證明抑制素陽性物質(zhì)主要分布于卵泡膜細胞和細胞間質(zhì)，而顆粒細胞、卵母細胞中分布較少或沒有分布。

3.2 抑制素基因在兩個綿羊品種間卵巢中相對表達量

抑制素會對卵泡發(fā)育、分化和成熟及排卵的過程起作用。卵泡發(fā)育是一個以形態(tài)變化為特征的生長過程，同時伴隨著卵泡功能的分化，原始卵泡經(jīng)過發(fā)育和分化后，可形成優(yōu)勢卵泡，使卵子成熟和排出，也可中途閉鎖。抑制素可通過自分泌及旁分泌對卵泡的正常生長分化及閉鎖起到刺激或抑制卵泡優(yōu)勢化過程中，抑制素數(shù)量逐漸增高。研究表明，在成年動物，抑制素水平在動情周期的顆粒細胞和卵泡膜細胞中變化最為明顯，這說明優(yōu)勢卵泡的選擇與抑制素表達有很大關(guān)系。Abdennebi［5］等通過對多胎的羅曼諾夫綿羊和單胎的法蘭西島綿羊研究發(fā)現(xiàn)，在小的有腔卵泡中，抑制素在顆粒細胞中有清晰的表達，但在卵細胞中，僅檢測到低水平的抑制素，在大的有腔卵泡中，抑制素水平在內(nèi)膜細胞和顆粒細胞中均有高度的表達。

由表1 和圖1 可以看出，多浪羊和卡拉庫爾羊初級卵泡和次級卵泡抑制素陽性表達率顯著高于(P ＜0.05) 原始卵泡和成熟卵泡。隨著卵泡發(fā)育，抑制素陽性細胞率呈遞增趨勢，直至腔前卵泡達到最高峰，隨之卵泡成熟而下降。各級卵泡抑制素的表達量多浪羊均比卡拉庫爾羊表達量高，但差異不顯著(P ＞0.05) 。該結(jié)果與Abdennebi［5］等的結(jié)果相一致。他們通過對高產(chǎn)的ROM 羊和低產(chǎn)IF 羊的研究也發(fā)現(xiàn)，在大的成熟卵泡的顆粒細胞中，僅檢測到低水平的抑制素，在小的有腔卵泡中，抑制素水平在顆粒細胞中有高度的表達。金萱［9］等研究發(fā)現(xiàn)，出生后5 d 的大鼠所分化的顆粒細胞中開始INHA 亞基基因表達，隨后逐漸增加至竇狀卵泡期達到高峰，健康的卵泡顆粒細胞中INHA 的活性強而卵母細胞中tPA 活性弱; 閉鎖卵泡卵母細胞中tPA 活性高，其顆粒細胞表達的INHA 的mRNA 活性較弱，說明顆粒細胞表達的抑制素A 與卵母細胞tPA 活性存在密切關(guān)系。說明在卵泡優(yōu)勢化過程中，抑制素起著非常重要的作用。抑制素作用于除了優(yōu)勢卵泡以外的其他卵泡，抑制其發(fā)育成熟，使其閉鎖，從而使優(yōu)勢卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵。

4 結(jié)論

多浪羊與卡拉庫爾羊的抑制素陽性物質(zhì)主要見于膜細胞和細胞間質(zhì)。多浪羊與卡拉庫爾羊在其初級卵泡和次級卵泡中抑制素的表達陽性率都顯著高于其原始卵泡和成熟卵泡(P ＜0.05) 。且隨著卵泡的不斷增大，抑制素水平在腔前卵泡之前達到高峰，隨后下降。因此，這可能與卵泡優(yōu)勢化有關(guān)，進而與多胎性有關(guān)。

［1］郭淑華.相關(guān)分子在哺乳動物原始卵泡啟動和生長中的作用［J］.濰坊學(xué)院學(xué)報.2010，(06).

［2］Robertson DM.Foulds LM.Leversha L.et al.ISolation of inhibin from bovine follicular fluid ［J］.Bioeheln.BioPhys.Res.Commun.，1985，126: 220-226.

［3］Campbell B K，Baird D T.Inhibin A is a follicle stimulating hormone responsive marker of granulosa cell differentiation，which has both autocrine and paracrine actions in sheep［J］.J Endocrinol，2001，169: 333-345.

［4］趙中權(quán).抑制素對山羊繁殖力的影響［M］.特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng).2011.

［5］Abdennebi，Wigglesworth K，Pendola F，et al.Murine oocytes suppress expression of luteinizing hormone receptor messenger ribonucleic acid by granulosa cells［J］.Biol Reprod，1997，56: 976-984.

［6］Bicsak T A，Vale W，VaughanJ，et a1.Hormonal regulation of inhibin production by cultured sertoli cells［J］.Mol Cell E.ndocrinol，1987，49: 211-7.

［7］王惠娥，汪瀾，尼亞孜布.卡拉庫爾羊卵巢中促性腺激素受體蛋白的分布［J］.畜牧與獸醫(yī).2013.(09).

［8］王惠娥，汪瀾，盛偉明.免疫組化法檢測促黃體素受體在多浪羊和卡拉庫爾羊卵巢上的分布［J］.中國畜牧獸醫(yī).2013.(03).

［9］金萱，劉以訓(xùn).卵泡生長、分化和閉鎖的調(diào)控［J］.科學(xué)通報.2003.(14).