馬晶晶，夏世敏，陳德林，王鳳學(xué)

(遵義市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義563002)

遵義地區(qū)2013年手足口病病毒亞型鑒定結(jié)果分析

馬晶晶，夏世敏，陳德林，王鳳學(xué)

(遵義市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義563002)

目的鑒定遵義地區(qū)手足口病病毒亞型，觀察其感染病毒類型特征。方法收集2013年1～12月期間于遵義市第一人民醫(yī)院就診的疑似手足口病例樣本，采用細(xì)胞分離結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測柯薩奇病毒A16型(CA16)、腸道病毒71型(EV71)及腸道病毒通用型(EV)的陽性率，并對所測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果①在2013年度所有疑似4680例手足口病患者的樣本檢測中陽性者1747例，占37.3%。②在1747例陽性檢測標(biāo)本中年齡小于2歲者895例，占所有陽性患者的51.23%；2～4歲者659例，占37.72%；4～6歲者187例，占10.70%；大于6歲者6例，占0.34%。③所有手足口病病毒陽性檢出患者中CA16型陽性者38例，占2.17%；EV71型陽性者203例，占11.62%；EV型陽性者1726例，占98.80%。結(jié)論2013年度遵義地區(qū)手足口病主要易感人群為4歲以下兒童，病毒流行亞型以腸道病毒EV型感染為主。

手足口?。荒c道病毒；亞型；遵義地區(qū)

腸道病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒和?？刹《編状箢?，其感染部位是包括口腔在內(nèi)的整個(gè)消化道，通過污染的食物、飲料、水果等經(jīng)口腔進(jìn)入體內(nèi)，并在腸道增殖引起相應(yīng)的臨床癥狀。手足口病(Hand-foot-mouth disease，HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下的兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù)患兒可引起肺水腫、心肌炎、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展快，可導(dǎo)致死亡，是未成年兒童常見的多發(fā)性流行病[1]。引發(fā)HFMD的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型，均為HFMD較常見的病原體，其中以柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和腸道病毒71型(EV71)最為常見[2]。貴州省疾控中心自2008以來年起，開始對省內(nèi)HFMD的發(fā)病流行情況進(jìn)行實(shí)時(shí)有效監(jiān)測。但由于個(gè)體遺傳易感性、地域和季節(jié)差異的原因，每年在各地區(qū)之間流行的病毒很可能各不相同，即使是同一地區(qū)，在年齡段患者所感染的病毒亞型也可能不盡相同。因此，本文通過回顧性分析2013年就診于我院的HFMD患者的病毒感染情況，以便了解遵義地區(qū)HFMD患者在過去一年里的感染亞型和流行趨勢，為更好地掌握該地區(qū)HFMD的發(fā)病情況、做好有關(guān)防控措施提供一定的數(shù)據(jù)資料。

1 資料與方法

1.1 樣本收集 收集2013年1～12月期間于遵義市第一人民醫(yī)院就診的疑似HFMD的門診及住院患者咽拭子樣本共計(jì)4680份，樣本采集人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，采集后樣本2℃～8℃條件下保存，24 h內(nèi)檢測分析。

1.2 試劑和儀器 柯薩奇病毒CA16型、腸道病毒71型及腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒、核酸提取試劑盒均來自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，Ligcycler480II型熒光定量PCR儀為上海羅氏制藥有限公司產(chǎn)品，Biosafe12生物安全柜購自Heal Force公司，微量移液器購自Eppendorf公司。

1.3 病毒核酸提取

1.3.1 樣本的處理 將所取咽拭子樣本在生理鹽水中充分?jǐn)噭?dòng)洗下拭子上粘附的細(xì)胞，取1.5ml洗滌后的生理鹽水于1.5ml離心管中，12000×g離心3min去除上清，沉淀充分振蕩混勻。

1.3.2 樣本核酸的提取 取200 μl樣品加入50 μl的蛋白酶K，再加入200 μl的裂解液，充分震蕩以去除雜蛋白，再向樣本中加入250 μl乙醇作用15 s。將混合液轉(zhuǎn)移至離心柱，12000×g離心1min。取出離心柱裝至新收集管，加入500 μl的抑制物去除液加入離心柱，室溫下12000×g離心1min，將離心柱裝至新的收集管，經(jīng)反復(fù)洗滌去除無機(jī)鹽離子和有機(jī)雜質(zhì)，得到核酸樣品。

1.4 熒光定量PCR擴(kuò)增 具體方法按試劑操作說明書進(jìn)行，總反應(yīng)體系25 μl，其中PCR反應(yīng)液15 μl，Taq酶3 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶2 μl，模板RNA5 μl。反應(yīng)條件：45℃15min，95℃2min，95℃5 s，55℃45 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR儀實(shí)時(shí)檢測檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動(dòng)繪制出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，根據(jù)Cp值實(shí)現(xiàn)對未知樣本的定性檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將所有樣本中病毒陽檢患者分成0～2歲，＞2歲且≤4歲，＞4歲且≤6歲及＞6歲以上四個(gè)年齡組，采用SPSS13.0軟件分別統(tǒng)計(jì)各年齡組患者陽性感染檢出率及各亞型病毒的陽性檢出率，觀察比較不同病毒亞型在各年齡段患者中的差異，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受檢樣本的整體情況 所檢測的4680例疑似患者樣本中有1747例患者呈感染陽性，占37.3%；其中男性1056例，女性691例。

2.2 各年齡段患者的陽性率比較1747例陽性樣本中年齡＜2歲的感染者895例，占51.23%，2～4歲者659例，占37.72%，而4～6歲和＞6歲的感染者分別為187例和6例，分別占所有感染者的10.70%和0.34%。

2.3 陽性感染患者的病毒亞型分布比較 在1747例陽性感染者中檢測出EV型病毒陽性的有1506例，占所有感染者的86.21%；另有11.62%(203例)為EV71型病毒感染；而CA16陽性感染的患者僅有38例，占2.17%。

3 討 論

HFMD是一種全球性傳染病，世界上大部分地區(qū)均有相關(guān)的流行報(bào)道，其主要臨床表現(xiàn)是以發(fā)熱、手、足、口腔發(fā)生水皰疹為特征。近年來，馬來西亞、中國臺灣、新加坡、澳大利亞和中國香港等地區(qū)不斷有手足口病暴發(fā)流行。引發(fā)HFMD的腸道病毒有多種，其中又以柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型和腸道病毒通用EV型最為常見，而EV71型腸道病毒感染易出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡[3-4]。HFMD的潛伏期為2～7 d，傳播途徑較多，可以經(jīng)糞-口、呼吸道傳播，或因接觸患者皮膚、黏膜皰疹液而感染[5]。在本文中，我們通過收集2013年全年來我院就診的疑似HFMD患者的樣本進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，病毒檢測確診為陽性感染患者多為學(xué)齡前兒童，其中以0～2歲最為多見(51.23%)，2～4歲兒童檢出率為37.72%，兩個(gè)年齡段的總發(fā)病率占88.95%，這與國內(nèi)其他地區(qū)所得出的流行病學(xué)結(jié)果基本一致[6-7]，提示我們在HFMD的防控措施方面應(yīng)該始終重點(diǎn)關(guān)注相應(yīng)年齡段的易感人群。至于HFMD發(fā)病率向4歲以下兒童人群傾斜的具體原因，可能與此年齡段兒童免疫功能尚未完全發(fā)育成熟有關(guān)。小兒免疫功能不全，容易感染發(fā)病。而成人的免疫功能比較完善，即使感染也一般不發(fā)病，但是成人感染后可能會間接傳染給小孩[8]。同時(shí)，分析結(jié)果還顯示，HFMD最常見的亞型為EV型，其次為EV71和CA16型，但作為臨床癥狀最為嚴(yán)重的EV71型病毒陽性患者占11.62%，這與臨床上觀察到的該型患者病情嚴(yán)重程度相契合，故在臨床實(shí)踐中一旦病毒學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)此型陽性，應(yīng)給予相應(yīng)患兒足夠的重視。再者，有研究提示手足口病毒感染后只能獲得感染亞型病毒的免疫力，對于其他病毒亞型沒有交叉免疫，所以還得始終預(yù)防HFMD某一亞型痊愈后再次感染其他病毒亞型而引起二次發(fā)病的情況[9]。

我們的結(jié)果還顯示，在臨床疑似HFMD病例的患者中，有相當(dāng)比例的患者病原檢測為陰性結(jié)合臨床表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)這部分患者臨床癥狀與HFMD陽性感染者非常相似，說明在診斷HFMD感染過程中需要特別謹(jǐn)慎，應(yīng)與具有相似癥狀的其他感染性疾病如扁桃體炎、皰疹性口腔炎、水痘等疾病相鑒別，應(yīng)盡早做到病毒學(xué)識別，把握最佳的治療時(shí)期，這是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

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Analysis on virus subtypes and epidemiological characteristics of hand-foot-mouth disease in Zunyi in2013.

MA Jing-jing,XIA Shi-min,CHEN De-lin,WANG Feng-xue.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Zunyi,Zunyi563002,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo investigate the virus subtypes of hand-foot-mouth disease(HFMD)in Zunyi,as well as to analyze the epidemiological features in this area.MethodsSamples of suspected HFMD cases in the First People's Hospital of Zunyi from January to December in2013 were collected.Cell separation combined with reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect the positive rate of coxsackie virus A16(CA16),enterovirus71(EV71)and enterovirus(EV).The results was statistically analyzed.Results(1)Among the4680 cases suspected of HFMD in2013,there were1747 positive infectious cases,which accounted for37.3%.(2)Among the1747 positive cases,there were895 cases of less-than-two-year-old children(accounting for51.23%),659 cases of2～4-year-old children(37.72%),187 cases of4～6-year-old children(10.70%),and only6 cases of more-than-6-year-old children(0.34%).(3)Among the1747 positive cases,there were38 cases of CA16 subtype(accounting for2.17%),203 cases of EV71 subtype(11.62%),and1726 cases of Enterovirus(EV)subtype(98.80%).ConclusionThe susceptible population of HFMD in Zunyi in2013 was the children under the age of4.The virus subtype was mainly EV.

Hand-foot-mouth disease;Enterovirus(EV);Subtype;Zunyi

R725.9

A

1003—6350（2015）20—3021—03

2014-09-13)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1099

王鳳學(xué)。E-mail：13511817091@163.com