陳海濱， 張國志， 李曙光， 王長友

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院普外科， 河北 唐山 063000)

BRCA1 BRCA2在結(jié)直腸息肉和癌中的表達及臨床意義

陳海濱， 張國志*， 李曙光， 王長友

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院普外科， 河北 唐山 063000)

目的:檢測同源修復(fù)基因家族成員BRCA1、BRCA2在結(jié)直腸息肉和癌中的表達，探討其與臨床病理特征的關(guān)系。方法:利用免疫組化SP法分別檢測27例正常結(jié)直腸粘膜、30例結(jié)直腸增生性息肉、33例結(jié)直腸腺瘤性息肉、60例結(jié)直腸腺癌組織中 BRCA1、BRCA2的表達水平。結(jié)果:BRCA1、BRCA2在正常結(jié)直腸粘膜、結(jié)直腸增生性息肉、結(jié)直腸腺瘤性息肉、結(jié)直腸癌組織中的表達率逐漸增高，差異有顯著性(P＜0.05)，二者的表達與結(jié)直腸癌中的性別、年齡、分化程度、Ducks分期等均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);二者在結(jié)直腸癌組織中的表達水平呈正相關(guān)(r=0.295，P＜0.05)。結(jié)論:BRCA1、BRCA2表達呈正相關(guān);二者可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展;聯(lián)合檢測結(jié)直腸病變組織中的BRCA1蛋白、BRCA2蛋白的表達水平有助于大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)。

結(jié)直腸增生性息肉; 結(jié)直腸腺瘤性息肉; 結(jié)直腸癌， BRCA1; BRCA2

結(jié)直腸癌是較常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其患者的生存率與腫瘤分期密切相關(guān)，多數(shù)患者就診時已處于進展期［1］，因而病死率較高。BRCA1、BRCA2基因同為抑癌基因，在DNA損傷修復(fù)、細胞周期調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要作用［2，3］。有研究表明［4，5］，多種腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)BRCA1的表達水平增高。本研究通過觀察結(jié)直腸息肉和癌中BRCA1、BRCA2蛋白的表達水平，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，及二者在結(jié)直腸癌組織中表達水平的相關(guān)性，探討聯(lián)合檢測BRCA1、BRCA2蛋白與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及在其預(yù)防、治療中的意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源:標(biāo)本均取自河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院2012年7月至2014年7月間病理存檔的石蠟標(biāo)本(共150例患者)。60例手術(shù)患者術(shù)前均未接受過放、化療，術(shù)后病理結(jié)果為腺癌，其中男性27例，女性33例，年齡34～80歲，平均年齡56.4歲;63例結(jié)直腸息肉患者，電子結(jié)腸鏡下切除后均經(jīng)病理證實:結(jié)直腸增生性息肉30例，結(jié)直腸腺瘤性息肉33例。另取27例結(jié)直腸外傷患者的正常粘膜組織做對照。

1.2 兔單抗BRCA1、BRCA2，DAB試劑均購于武漢博士德公司。

1.3 方法:免疫組化法:石蠟切片脫蠟至水;3%H2O2室溫孵育5～10min;蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，再行微波抗原修復(fù);5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例(1:100)的一抗兔抗人BRCA1單克隆抗體(博士德公司)兔抗人、BRCA2單抗(1:100，博士德生物公司)50～100μl覆蓋組織，4℃過夜;PBS沖洗，5min×3次;滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗工作液37℃孵育30min;PBS沖洗，5min×3次;滴加1～2滴辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育30min;PBS沖洗，5min×3次; DAB顯色劑顯色;自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。同種控制一抗條件盡量相同，每例至少染3張切片。

1.4 判斷方法:結(jié)果判定:在5個高倍視野下進行計數(shù)，隨機計數(shù)200個細胞中的陽性細胞所占比例，依據(jù)陽性細胞數(shù)進行計數(shù)。BRCA1和BRCA2陽性細胞表現(xiàn)為細胞核和細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕紅色顆粒，陽性細胞數(shù)≤10%為陰性表達，陽性細胞數(shù)＞10%為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料進行χ2檢驗;相關(guān)性分析采用非參數(shù)Spearman秩相關(guān)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同結(jié)直腸組織BRCA1蛋白、BRCA2蛋白表達:BRCA1在正常大腸黏膜中無表達，在增生性息肉、腺瘤性息肉及結(jié)直腸癌中的表達依次為26.7%、54.5%、71.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.32，P＜0.01)。BRCA2在正常大腸黏膜中無表達，在增生性息肉、腺瘤性息肉及結(jié)直腸癌中的表達依次為23.3%、45.5%、65.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=44.74，P＜0.05)。見表1。

表1 BRCA1 BRCA2在結(jié)直腸息肉和癌中的表達

圖1

2.2 BRCA1蛋白、BRCA2蛋白的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系:兩者蛋白表達水平與性別、年齡、分化程度、Ducks分期等均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。在低分化、Dukes分期C和D期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各組中，BRCA1蛋白陽性表達率分別為80.0%、70.8%和72.1%;在高分化、Dukes分期A和B期及無淋巴轉(zhuǎn)移各組中，BRCA1蛋白陽性表達率分別為16.7%、33.3%和41.2%，三組中BRCA1蛋白陽性表達率呈遞增趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在潰瘍型、Dukes分期C和D期和遠端轉(zhuǎn)移各組中，BRCA2蛋白陽性表達率分別為54.2%、68.8%和45.2%;在腫塊型、Dukes分期A和B期及無遠端轉(zhuǎn)移各組中，BRCA2蛋白陽性表達率分別為23.1%、58.3%和17.2%，三組中BRCA2蛋白陽性表達率呈遞增趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 結(jié)直腸癌組織中BRCA1蛋白、BRCA2蛋白表達的相關(guān)性分析:BRCA1蛋白與BRCA2蛋白均陰性者為31.7%(19/60)，BRCA2蛋白在BRCA1蛋白陰性表達中的表達率為 86.4%(19/22)，BRCA1蛋白與BRCA2蛋白均陽性者為26.7%(16/60)，BRCA2蛋白在BRCA1蛋白陽性表達中的表達率為42.1%(16/ 38)，統(tǒng)計學(xué)分析r=0.295，P=0.022，兩者的表達呈正相關(guān)，見表3。

表3 BRCA1、BRCA2在癌組織中表達的相關(guān)性 (n)

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制尚未完全闡釋，大多認(rèn)為是多種癌基因與抑癌基因相互作用的結(jié)果，是多因素、多步驟及長時間作用的過程。DNA的損傷是惡性腫瘤發(fā)生的重要原因之一，在DNA分子中存在的多種形式的損傷中，DNA的雙鏈斷裂(double－strand break，DSB)是DNA最為嚴(yán)重的損傷形式，如果不能得到及時而準(zhǔn)確地修復(fù)，它可能會導(dǎo)致基因的突變、基因組的不穩(wěn)定、細胞的染色體的丟失和重組或者導(dǎo)致細胞的凋亡甚至癌變。有研究發(fā)現(xiàn)［6］，大腸癌患者集中的斷裂位點為1p32－tem、4p12－G12、4p31、5G21～31、7p15、14G22～24，染色體的這些位點攜帶著多個癌基因、抑癌基因、生長因子基因如 L－myc MTS1、p73、MCC、APC等。同源重組(homologous recombination，HR)是哺乳動物細胞修復(fù) DNA雙鏈斷裂(doubles strand breaks，DSBS)的一種重要方式，高度保真的HR對維持基因組的穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用。在DNA進行復(fù)制的過程當(dāng)中，當(dāng)雙鏈DNA中的一條鏈發(fā)生損傷時，由于該損傷的部位是不能成為修復(fù)模板的，因為不能根據(jù)它來合成互補的DNA鏈，所以會產(chǎn)生DNA鏈缺口，而從原來DNA鏈的對應(yīng)部位切割出一段相應(yīng)的部分來填補所產(chǎn)生的缺口，從而產(chǎn)生出了完整而且沒有損傷的子代DNA的這種修復(fù)途徑，就是同源重組修復(fù)途徑。研究表明同源重組相關(guān)分子缺陷或者過表達與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。當(dāng)大腸癌相關(guān)基因損傷后BRCA1蛋白、BRCA2蛋白和其他分子共同感應(yīng)DNA損傷，并將損傷信號傳遞到下游基因，由此啟動HR參與DNA損傷修復(fù)。

本文所有病例的臨床病理學(xué)特征均已得到證實，通過觀察150例結(jié)直腸良惡性病變患者組織BRCA1、BRCA2蛋白的陽性表達率，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白的陽性表達率分別隨著大腸病變惡性度的增加呈遞增趨勢，二者的高表達與結(jié)直腸腺瘤性息肉的大小及有蒂無蒂有關(guān)，在結(jié)直腸癌中的陽性表達率與分化程度、Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無統(tǒng)計學(xué)差異，但二者的表達在結(jié)直腸癌組織中呈明顯正相關(guān)。BRCA1、BRCA2的表達與結(jié)直腸癌的臨床病理特征無相關(guān)性，可能與標(biāo)本來源的局限性及標(biāo)本數(shù)量不足有關(guān)。二者隨著結(jié)直腸病變的惡性度升高而呈遞增趨勢，我們可以推測在結(jié)直腸病變的發(fā)生、發(fā)展過程中HR通路激活，進而導(dǎo)致BRCA1蛋白、BRCA1蛋白的表達增加。

因此，聯(lián)合檢測結(jié)直腸病變組織中的BRCA1蛋白、BRCA2蛋白的表達水平有助于大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)。通過探討二者的表達規(guī)律，從而為結(jié)直腸良、惡性疾病的危險評估、檢測及預(yù)防提供參考，并且有可能為結(jié)直腸癌的基因治療提供新的途徑。目前，真核生物HR途徑的研究也已逐步應(yīng)用到了治療腫瘤的領(lǐng)域中。二者在流行病學(xué)上有許多相似之處，本文表明二者在結(jié)直腸癌中的表達呈正相關(guān)，暗示它們的mRNA表達受到協(xié)調(diào)調(diào)控。這兩種蛋白的基因定位和mRNA編碼已經(jīng)清楚，但其完整的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)功能尚不完全清楚，其與其它腫瘤廣泛的相關(guān)性也需要進一步研究。

［1］汪露，江濱.大腸癌篩查方法研究進展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，5:236～239.

［2］Vollebergh MA，Jonkers J，Linn SC.Genomic instability in breast and ovarian cancers:translation into clinical predictive biomarkers［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69(2):223～245.

［3］Roy R，Chun J，Powell SN.BRCA1 and BRCA2:different roles in a common pathway of genome protection［J］.Nat Rev Cancer，2012，12(1):68～78.

［4］Qiao G B，Wu Y Y，Yang X N，et al.High－level expression of Rad51 is an independent progostic marker of survival in non－small－cell lung cancer patient［J］.Br Cancer，2005，93 (1):137～143.

［5］Soderlund K，Skoog L，F(xiàn)ornander T，et al.The BRCA1/ BRCA2/Rad51 complex is a prognostic and predictive factor in early breast cancer［J］.Radiother Oncol，2007，84 (3):242～251.

［6］邵麗娜，來茂德.結(jié)直腸癌染色體斷裂率的研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，1:72～75.

Expression of Colorectal Polyp and Cancer BRCA1 BRCA2 and the Clinical Significance

CHEN Haibin， ZHANG Guozhi， LI Shuguang， WANG Changyu
(The Affiliated Hospital of Hebei United University，Hebei Tangshan063000，China)

Objective:To detect members of the family of homologous repair genes BRCA1 and BRCA2 expression in colorectal polyps and cancer，to explore its relationship with the clinical pathological features.Method:By using immunohistochemical SP method detected 27 cases of normal colorectal mucosa，30 cases of colorectal hyperplastic polyp，33 cases of colorectal adenomas sex polyp，60 cases of colorectal adenocarcinoma tissue protein BRCA1 and BRCA2 protein expression，analysed the physical index and the correlation with colorectal polyps and cancer.Result:BRCA1 and BRCA2 in normal colorectal mucosa，colorectal hyperplastic polyp，colorectal adenomas polyps and colorectal cancer expression rate increased gradually in the organization，and had significant difference(P＜0.05)，the expression in colorectal cancer such as sex，age，degree of differentiation，Ducks stage had no statistical difference(P＞0.05)，both in the tissue of colorectal cancer expression level significantly positively correlated(r=0.295，P＜0.05).Conclusion:Expression of BRCA1 and BRCA2 are positively correlated，both may participate in the occurrence and development of colorectal polyps and cancer.Joint detection of colorectal lesions in the organization the expression of BRCA1 protein and BRCA2 protein levels for early detection of colorectal cancer.

Colorectal hyperplastic polyp; Colorectal adenomas sex polyp; Colorectal cancer，BRCA1;BRCA2

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.019

1006－6233(2015)05－0763－05

* 通訊作者