畢明輝，程 誠(chéng)，李 鵬，吳平生

（1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣州510515；2.廈門市中醫(yī)院心血管科，福建廈門361009；3.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)科，廣東珠海519000）

近年來，心腦血管病的發(fā)病率逐年升高，其中由動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)疾病的病死率逐年上升，防治動(dòng)脈粥樣硬化，研究其病因、病理機(jī)制成為研究重點(diǎn)。研究表明，中藥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有顯著防治作用，黃芩苷是從黃芩根中提取獲得的黃酮類單體化合物［1－2］。有研究表明，黃芩具有多種藥理作用［3－4］，如抗氧化、抗炎、抑制平滑肌增殖、調(diào)節(jié)免疫等，黃芩苷亦具有多種藥理作用，如調(diào)節(jié)血脂、恢復(fù)凝血－纖溶系統(tǒng)平衡等。但黃芩苷對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用及其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究通過構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，觀察黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠主動(dòng)脈壁細(xì)胞內(nèi)核因子（NF－κB）、纖溶抑制物（TAFI）及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）表達(dá)水平影響，探討黃芩苷防治動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí) Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量250.0～350.0g，適齡，健康，共40只，均購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度控制在25℃，濕度7%，自動(dòng)通風(fēng)器保持室內(nèi)通風(fēng)。普通飼料及高脂飼料均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 黃芩苷（山東魯抗大禹藥業(yè)有限公司），TAFI發(fā)色底物試劑盒（美國(guó)DIAGNOSTlCA公司），維生素D3（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20058981），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 購(gòu)進(jìn) Wistar大鼠后，先喂養(yǎng)1周普通飼料，后隨機(jī)分為4組，每組10只，即假手術(shù)組、模型組、黃芩苷高劑量組、黃芩苷低劑量組。假手術(shù)組大鼠給予普通飼料，剩余組別大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第7天后大鼠進(jìn)行主動(dòng)脈球囊損傷手術(shù)［5］，在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)于大鼠的右下肢肌內(nèi)注射維生素D3（針劑30萬(wàn)U/kg），隔1個(gè)月肌內(nèi)注射1次，周期4個(gè)月，建立動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型。假手術(shù)組、模型組大鼠肌內(nèi)注射生理鹽水2mL，每天1次；黃芩苷高劑量組肌內(nèi)注射黃芩苷150mg·kg－1·d－1，每天1次；黃芩苷低劑量組肌內(nèi)注射黃芩苷100mg·kg－1·d－1，每天1次。給藥8周后，處死所有動(dòng)物，發(fā)色底物法測(cè)定血漿TAFI的活性，免疫組織化學(xué)法測(cè)定NF－κB、ACE2表達(dá)水平。

1.2.2 測(cè)定血漿TAFI的活性 在給藥第8周末，大鼠空腹12h后，心臟取血，按照試劑盒步驟測(cè)定TAFI活性。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)定 測(cè)定NF－κB、ACE2表達(dá)水平：取血后，脫臼處死大鼠，取主動(dòng)脈，置于10%甲醛溶液中，固定24h后，取出、包埋、切片（4μm），然后將組織切片置于涂有多聚賴氨酸的玻片上，37℃烤片，過夜，4℃保存?zhèn)溆?。免疫組織化學(xué)操作步驟參考文獻(xiàn)［6－7］方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：NF－κB、ACE2染色陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或者褐色顆粒。每只大鼠選取4張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（×200）陽(yáng)性著色區(qū)域，然后采用圖像軟件測(cè)定陽(yáng)性染色細(xì)胞棕色顆粒的平均吸光度值（OD值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血漿TAFI表達(dá)影響實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠采食飲水等活動(dòng)均正常，毛色光亮柔滑，生命體征良好，飲食、毛色及外觀未見明顯異常。與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠TAFI活性均明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)過黃芩苷治療后，黃芩苷高、低劑量組TAFI明顯低于模型組（P＜0.05），見表1。

2.2 黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠NF－κB表達(dá)水平影響與假手術(shù)組比較，其余各組 NF－κB明顯降低（P＜0.05）；經(jīng)過黃芩苷灌胃給藥治療后，與模型組比較，黃芩苷高、低劑量組NF－κB均明顯升高（P＜0.05），見表1。

2.3 黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠ACE2表達(dá)水平影響與假手術(shù)組比較，其余各組ACE2活性明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)過黃芩苷灌胃給藥治療后，與模型組比較，黃芩苷高、低劑量組ACE2活性均明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血漿TAFI、NF－κB、ACE2活性表達(dá)影響（±s）

表1 黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血漿TAFI、NF－κB、ACE2活性表達(dá)影響（±s）

a：P＜0.05，與假手術(shù)組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與模型組比較。

組別 n TAFI（μg/L） NF－κB ACE2活性假手術(shù)組10 27.56±0.10 167.52±7.82 75.28±7.32模型組 10 34.38±5.26a66.69±9.26a148.63±9.15a黃芩苷高劑量組 10 31.07±2.53ab 128.47±8.45ac103.84±8.53ab黃芩苷低劑量組 10 30.11±1.74ab 112.75±9.14ab111.35±8.46ab

2.4 黃芩苷對(duì)大鼠主動(dòng)脈免疫組織化學(xué)染色NF－κB表達(dá)的影響 大鼠主動(dòng)脈NF－κB免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察，假手術(shù)組 NF－κB OD 值為0.100±0.008；模型組 NF－κB表達(dá)明顯降低，OD值為0.350±0.014，斑塊內(nèi)可見大量淺紫紅色陽(yáng)性顆粒；黃芩苷高劑量組OD 值為0.270±0.010，NF－κB表達(dá)明顯增加，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，黃芩苷低劑量組NF－κB的表達(dá)增加差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.5 黃芩苷對(duì)大鼠主動(dòng)脈免疫組織化學(xué)染色ACE2表達(dá)的影響 主動(dòng)脈ACE2免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察，假手術(shù)組ACE2 OD值為0.120±0.006。模型組ACE2表達(dá)明顯增加，OD值為0.430±0.020，斑塊內(nèi)可見大量棕黃色陽(yáng)性顆粒，以細(xì)胞質(zhì)為主，細(xì)胞核內(nèi)有少量表達(dá)。黃芩苷高劑量組OD值為0.230±0.012，黃芩苷低劑量組OD 值為0.310±0.011，ACE2表達(dá)明顯減少，與模型組相比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠NF－κB活性表達(dá)水平影響

圖2 黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠ACE2活性表達(dá)水平影響

3 討 論

目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，有研究報(bào)道，高血壓、血脂異常、炎癥、凝血－纖溶系統(tǒng)平衡失調(diào)是常見高危因素［6］。因此，防治動(dòng)脈粥樣硬化，研究其病因、病理機(jī)制成為重點(diǎn)。有研究報(bào)道［3－4］，黃芩苷具有多種藥理作用，尤其在調(diào)節(jié)血脂、恢復(fù)凝血－纖溶系統(tǒng)平衡等方面。本研究通過構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，觀察黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠NF－κB、TAFI及ACE2表達(dá)水平影響，探討黃芩苷防治動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制。

有研究表明，腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，高血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）水平通過提高基質(zhì)金屬蛋白酶活性，促進(jìn)血管平滑肌遷移及促進(jìn)合成炎癥因子并激活炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)通路等途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成［7］。ACE2水解 AngⅡ生成 Ang（1－7），水解產(chǎn)物具有強(qiáng)烈舒張血管效應(yīng)，在炎癥及血管平滑肌增殖等過程中可發(fā)揮有益效應(yīng)。是心血管系統(tǒng)的保護(hù)因子。ACE2通過降低AngⅡ水平，生成Ang（1－7）發(fā)揮舒張血管的作用。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，其余各組大鼠主動(dòng)脈壁ACE2表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)過黃芩苷治療后，黃芩苷藥物組ACE2表達(dá)水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組TAFI改善更優(yōu)。提示，黃芩苷可通過上調(diào)ACE2表達(dá)抗動(dòng)脈粥樣硬化。

肝臟可合成TAFI，TAFI是一種羧肽酶樣活性蛋白，通常無活性。在體內(nèi)纖溶酶、凝血酶等可激活TAFI，從而起到抗纖溶作用。有研究表明［8］，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中，TAFI水平隨著動(dòng)脈粥樣硬化程度加重而升高，說明動(dòng)脈粥樣硬化中有TAFI參與。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，其余各組大鼠TAFI活性均明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)過黃芩苷治療后，與模型組比較，黃芩苷藥物組TAFI明顯低于模型組（P＜0.05）。與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組TAFI改善更優(yōu)。TAFI主要作用于纖維蛋白羧基端，導(dǎo)致纖溶酶無法與纖維蛋白結(jié)合，抑制了纖溶活性，溶栓時(shí)間延長(zhǎng)，血栓形成危險(xiǎn)升高。

動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中，NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，將會(huì)過量表達(dá)，調(diào)控黏附分子細(xì)胞因子、免疫受體、急性期蛋白等基因表達(dá)，在炎性反應(yīng)中具有重要作用［9－11］。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，其余各組大鼠主動(dòng)脈壁細(xì)胞內(nèi)核因子NF－κB表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)過黃芩苷治療后，黃芩苷藥物組NF－κB表達(dá)水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組 NF－κB表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

本研究結(jié)果顯示，黃芩苷抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制可能通過下調(diào)TAFI水平，恢復(fù)凝血－纖溶系統(tǒng)平衡；下調(diào)NF－κB表達(dá)，減少炎性反應(yīng)；上調(diào)ACE2表達(dá)，舒張血管。綜上所述，模型組大鼠TAFI、NF－κB表達(dá)水平明顯升高，ACE2表達(dá)水平明顯降低，黃芩苷可能通過下調(diào)TAFI，NF－κB表達(dá)，上調(diào) ACE2表達(dá)，發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

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