梅愛農(nóng) 張?zhí)K明 (福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院干部特診一科，福建省臨床老年病研究所，福建省立醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究室，福州350001)

據(jù)研究，不成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cell，imDC)和免疫抑制因子作用下的耐受性樹突狀細(xì)胞(Tolerogenic DC，TDC)能誘導(dǎo)抗原特異性耐受［1］，另外研究表明干細(xì)胞或其衍生細(xì)胞如神經(jīng)前體細(xì)胞(Neural progenitor cell，NPC)，在特定的移植背景下會(huì)誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，提示這類細(xì)胞移植仍然需要考慮移植排斥反應(yīng)［2］。為此，本研究試圖利用胚胎干細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞(esDCs)來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)同源性干細(xì)胞來(lái)源物比如NPCs 的免疫耐受，因?yàn)檠芯勘砻鱡sDCs 可能與傳統(tǒng)骨髓源性imDC 一樣具有致耐受性［3，4］。研究中將利用胚胎干細(xì)胞來(lái)源的兩種細(xì)胞NPCs 和esDCs 的聯(lián)合移植，來(lái)觀察esDCs 對(duì)局部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子的偏移、外周淋巴系統(tǒng)的增殖性以及對(duì)NPC 細(xì)胞腦內(nèi)存活的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6～8 周齡健康Sprague-Dawley 大鼠，體重180～220 g，隨機(jī)分成2組，每組18 只，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心。主要儀器:倒置相差熒光顯微鏡(Olympus CK40)、CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BD Pharmingen)、酶標(biāo)測(cè)定儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(BioRad)、PCR 儀(Biometra)、SW-CJ 標(biāo)準(zhǔn)型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、江灣Ⅰ型C 鼠腦立體定位儀等。主要材料及試劑:pCXhrGFP ES-D3 ESCs、ES-D3 ESCs、SNL 細(xì)胞系來(lái)自同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科試驗(yàn)室;DMEM、DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、100×N2-supplement、50×B27 supplement、rm-bFGF(Gibco、Bibco BRL);纖維連接蛋白(Fn)、煙酰胺、β-巰基乙醇(Sigma);100×ITS 培養(yǎng)液(Hyclone);人白血病抑制因子(LIF)、兔抗Cy3-Nestin (Chemicon);rmIL-2、rmIFN-γ、rmGM-CSF、rmIL-3(Peprotech);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Amresco);絲裂霉素C(Kyowa Hakka Kogyo Co.Lid);鼠抗FITC-MHC-Ⅰ、FITC-MHC-Ⅱ、CD4、CD8;兔FITCCD11c、PE-CD80、PE-CD83、PE-CD86(BD Pharmingen);鼠抗ED1(CD68)(Serotec);羊抗小鼠IgM 二抗、DAB 染色試劑盒(北京中杉金橋有限公司);Trizol 試劑盒(Omega Bio-tek，Inc);cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒(Fermentas，USA)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pCX-hrGFP ES-D3 向NPCs 誘導(dǎo)分化 pCX-hrGFP ES-D3 用LIF 條件培養(yǎng)基(1%L-谷氨酰胺，1%β-巰基乙醇，1%青-鏈霉素溶液，1%非必需氨基酸，DMEM 培養(yǎng)液，20 ng/ml LIF)懸浮，于0.1%明膠包被的無(wú)滋養(yǎng)層的塑料培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)滿瓶底的80%后，倒掉培養(yǎng)基，Trypsin/EDTA 消化、離心細(xì)胞后將單細(xì)胞懸液加入ES 完全培養(yǎng)基(LIF 條件培養(yǎng)基去除LIF)重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105ml-1，按照(2～2.5)×104/cm2接種到低黏性細(xì)菌培養(yǎng)皿，加入ES 完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d，細(xì)胞由接種時(shí)的單細(xì)胞長(zhǎng)成懸浮的圓形細(xì)胞團(tuán)，即擬胚體(EBs)。收集第4天的EBs 轉(zhuǎn)移到新的25 cm 普通培養(yǎng)瓶，添加ES 完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)24 h，待EBs 完全貼壁后輕輕倒掉培養(yǎng)基。加入無(wú)血清ITSF 培養(yǎng)基(5 mg/L insulin，50 μg/L 轉(zhuǎn)鐵蛋白，30 mmol/L 硒酸鈉，5 mg/L 纖維連接蛋白)，連續(xù)培養(yǎng)6 d。Trypsin/EDTA 消化，離心后加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1% N2-supplement，1% B27-supplement，TrisbFGF 50 μl/50 ml DMEM/F12 培養(yǎng)基)將細(xì)胞重新懸浮，按照(1.5～2)×104/cm2接種到新的培養(yǎng)瓶。添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)6 d，隔天換液一次。Nestin 熒光染色免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。

1.2.2 esDCs 的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及基本生物學(xué)特征檢測(cè) 將在無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的ESCs 消化成單細(xì)胞懸液，按照(2～2.5)×104/cm2接種到低黏性細(xì)菌培養(yǎng)皿，加入EB 全培養(yǎng)基(20%FBS DMEM+1%L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、青-鏈霉素溶液)，置37℃，5%CO2飽和濕度溫箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d，細(xì)胞由接種時(shí)的單細(xì)胞長(zhǎng)成懸浮的圓形細(xì)胞團(tuán)，即EBs。EBs 培養(yǎng)第14 天后轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)瓶，加入EB 全培養(yǎng)液置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)過夜。待EBs 完全黏附后，換入esDC誘導(dǎo)培養(yǎng)基(終濃度為25 ng/ml rmGM-CSF 與10 ng/ml rmIL-3 的EB 全培養(yǎng)基)置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。加入0.05%胰蛋白酶-EDTA 消化細(xì)胞3～5 min，加入等量培養(yǎng)液中止消化，并用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。離心后棄上清，加入esDC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞密度至1×106ml-1，按照(3～5)×105cell 接種到新的培養(yǎng)瓶置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。隔日換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿80%瓶底后傳代。流失細(xì)胞術(shù)檢測(cè)初始型細(xì)胞及脂多糖誘導(dǎo)下MHCⅠ、MHCⅡ、CD11c、CD80、CD86 表達(dá)。

1.2.3 NPCs 體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn) 健康Sprague-Dawley大鼠，體重180～220 g，隨機(jī)分成esDCs 預(yù)處理組及對(duì)照組2 組，每組18 只。采用改良的線拴法制作MCAo 模型:用6%水合氯醛麻醉大鼠，頸部正中切口結(jié)扎頸外動(dòng)脈，再在頸總動(dòng)脈下方穿過2 條結(jié)扎線，將近心的線扎緊后，在兩線之間的血管壁上剪一個(gè)小口，插入0.2 mm 鈍頭釣魚線緩慢推進(jìn)，感輕微阻力時(shí)停止，即為缺血開始，扎緊結(jié)扎線并固定插線，缺血1 h 后再將插線拔除，讓缺血區(qū)得到再灌注，為再灌注開始。NPC 腦內(nèi)移植:MCAo 術(shù)后1周，esDCs 預(yù)處理組動(dòng)物尾靜脈輸注5×105esDCs，對(duì)照組注射PBS。術(shù)后2 周，兩組大鼠用6%水合氯醛麻醉，按Pellegrino 鼠腦定向圖譜行側(cè)腦室注射定位(以前囟為零點(diǎn)，前囟前0.7 mm，旁開2.0 mm，深3.5 mm)5×104pCX-hrGFP NPCs。

1.2.4 ED1、CD4、CD8 免疫組織化學(xué)檢測(cè)(n=6)移植2 周后(缺血后4 周)動(dòng)物6%的水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，4%的多聚甲醛灌注。取腦后于4%的多聚甲醛后固定6 h。于移植針孔后1 mm 連續(xù)冰凍切片，厚度20 μm，隔3 取1，分別對(duì)應(yīng)行鼠抗ED1、CD4、CD8 免疫組化檢測(cè)。切片于3%過氧化氫孵育5 min，正常羊血清室溫下孵育20 min，吸干，加一抗抗體(1 ∶200)4℃過夜，按試劑盒說(shuō)明書加入二抗，DAB 染色后常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢并照相。對(duì)應(yīng)每個(gè)分子檢測(cè)，每只大鼠取3張切片，40×物鏡下在紋狀區(qū)隨機(jī)選取4 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)3 張切片共12 個(gè)視野細(xì)胞總數(shù)(面積0.72 mm2)。

1.2.5 淋巴細(xì)胞再刺激(n=6) 移植2 周后(缺血后4 周)分離培養(yǎng)頸部淋巴細(xì)胞，調(diào)整密度5×105ml-1。NPCs 細(xì)胞計(jì)數(shù)按5×104NPCs(200 μl)/孔接種96 孔板，用含F(xiàn)GF 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)5 d，在淋巴細(xì)胞加入之前2 h 加入絲裂霉素C(20 μg/ml)滅活。每只動(dòng)物取4 份5×104(100 μl)淋巴細(xì)胞分別加入3 個(gè)滅活的NPC 孔樣和一個(gè)空白孔樣，同時(shí)加入重組rIL-2 刺激淋巴細(xì)胞增殖，另外預(yù)留一個(gè)滅活NPC 的孔樣，加入100 μl 含F(xiàn)GF的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每只動(dòng)物都對(duì)應(yīng)3 個(gè)“淋巴細(xì)胞+NPC”孔樣，計(jì)為“LN”;1 個(gè)“淋巴細(xì)胞”孔樣，記為“L”;1 個(gè)“NPC”孔樣，記為“N”。在37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中孵育68 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4～6 h培養(yǎng)板各孔加入1 mg/ml MTT 液在37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)6 h 后，每孔加入2%SDS 過夜培養(yǎng)。用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)570 nm 下的吸光度(A570)，淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)用以下公式進(jìn)行校正:PI=(LNA570nm-NA570 nm)/LA570 nm。

1.2.6 NPC 存活率的測(cè)定(n=6，來(lái)源同淋巴細(xì)胞再刺激亞組) 移植2 周后(缺血后4 周)，每組取6 只斷頭取腦，Oct 包埋，放入-70℃冰箱保存。連續(xù)冠狀面冰凍切片，厚度20 μm，隔10 取1。收集穿刺點(diǎn)前后約±0.5 mm 的腦片，觀察區(qū)(Regions of interest，ROI)為同側(cè)的紋狀體，在熒光顯微鏡×40 物鏡下取10 個(gè)對(duì)等的視野進(jìn)行GFP 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.7 IFN-γ、IL-10 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)(n=6) ①引物設(shè)計(jì)與合成:(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成)，內(nèi)參β-actin (GenBank NM-031144):正義:5'-CATCCAGGCTGTGTTGTCCC-3'，反義:5'-TTCTCTTTAATGTCACGCACG-3'(240 bp);IFN-γ:正 義5'-GCTGGTGAATCACTCTGATG-3'，反義5'-GCCAAGGCACACTGATTGAA-3' (360 bp);IL-10:正義5'-AAACTCATTCATGGCCTTGTA-3'，反義5'-TGCCTTCAGTCAAGTGAAGACT-3' (346 bp)。②總RNA 的提取:移植2 周后(缺血后4 周)，每組各取6 只大鼠快速斷頭處死，取缺血側(cè)皮層和紋狀體50～100 mg 樣本，加入1 ml RNA 裂解液之后按每1 ml RNA 勻漿加265 μl 氯仿的比例，向Ep 管里加入適量氯仿，離心后按每1 ml RNAsolv 加入670 μl 異丙醇的比例向轉(zhuǎn)移的水相中加入異丙醇以沉淀RNA。離心后用75% 乙醇沉淀RNA 沉淀之后將RNA 重新溶解于Rnase-free 水中(50 μl)測(cè)定RNA濃度和純度，選取純度達(dá)標(biāo)的樣本放入-70℃保存。③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20 μl。將總RNA 反應(yīng)混合物(總RNA 10 μl，0.5 μg/ml OdT 1 μl，去離子水1 μl)加入200 μl Ep 管內(nèi)，置于70℃5 min，立刻冰水浴2 min 然后短暫離心。按照下列順序?qū)⒏髟噭┘尤肷鲜龉苤?5×反轉(zhuǎn)錄buffer 4 μl;RNA 酶抑制劑1 μl;10 mmol/L dNTP Mix 2 μl;MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl)1 μl，將反應(yīng)混合物置于42℃60 min，在70℃加熱10 min 終止上述反應(yīng)，然后置于冰上。以上合成的第一鏈cDNA 可以直接地用于PCR 擴(kuò)增。④PCR 擴(kuò)增:將下列反應(yīng)物［10×PCR 緩沖液2 μl;2 mmol/L dNTP mix 2 μl;引物Ⅰ(10 μm)2 μl;引物Ⅱ(10 μm)2 μl;Taq DNA 聚合酶0.1 μl;25 mmol/L MgCl21.2 μl;DNA 模板5 μl;消毒雙蒸水5.7 μl］加入一個(gè)PCR 管中，置于冰上，混勻，短暫離心。將樣本加入熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增:初始變性過程-95℃3 min;變性、退火、延伸30個(gè)循環(huán)，變性為94℃1 min，退火為55℃40 s，延伸為70℃1 min;終末延伸過程:70℃ 10 min。⑤PCR產(chǎn)物的檢測(cè):PCR 產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察照相，采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析，根據(jù)樣品條帶光密度值與β-actin 光密度值之比確定樣品mRNA 含量。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備和鑒定 自pCX-hrGFP ES-D3 mESCs 誘導(dǎo)分化的NPCs 常規(guī)消化后在bFGF 條件下保持?jǐn)U增能力，并傾向于集落生長(zhǎng)。Nestin 熒光染色顯示雙標(biāo)陽(yáng)性率為94% 以上，表明經(jīng)pCXhrGFP 轉(zhuǎn)染的ES-D3 mESCs 能穩(wěn)定表達(dá)GFP 綠色熒光并在傳代和誘導(dǎo)分化中保持熒光的穩(wěn)定性。是可靠的細(xì)胞分子標(biāo)記物，可用于移植中的細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)記(圖1A～C)。

圖1 細(xì)胞準(zhǔn)備和鑒定:分別自pCX-hrGFP ES-D3 誘導(dǎo)NPCs 和ES-D3 誘導(dǎo)esDCsFig.1 Cell preparation and identification:differentiation of NPCs from pCX-hrGFP ES-D3 and esDCs from ES-D3 respectively

圖2 兩組大鼠紋狀體CD4，CD8，ED1 陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)Fig.2 Infiltration of CD4，CD8，ED1 positive cells in striatum in two groups

圖3 兩組大鼠缺血腦組織炎癥因子表達(dá)Fig.3 Expression of inflammatory cytokine in ischemia lesions in two groups

圖4 兩組大鼠缺血紋狀體移植細(xì)胞存活比較Fig.4 Survivals of grafted cells in ischemic striatum in two groups

圖5 兩組大鼠頸部淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)比較Fig.5 Proliferation indexes (PI) of cervical T lymphocytes in two groups

ES-D3 mESCs 經(jīng)“擬胚體”在細(xì)胞因子GM-CSF及IL-3 的作用下誘生的esDCs 呈集落性生長(zhǎng)，運(yùn)用傳統(tǒng)的消化方法將這些細(xì)胞繼代培養(yǎng)，在GM-CSF及IL-3 存在的情況下能繼續(xù)擴(kuò)增，而保持一致的細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)顯示這些細(xì)胞CD11chiMHCⅠmoMHCⅡloCD80loCD83loCD86lo。在連續(xù)培養(yǎng)超過4 周的時(shí)間后，細(xì)胞表面的MHCⅡ分子及共刺激分子CD80 等的表達(dá)未見上調(diào)。但esDCs 細(xì)胞在脂多糖的作用下，逐漸向成熟DC 形態(tài)發(fā)展，在培養(yǎng)的第4 天，大量的釘狀突起從周圍生長(zhǎng)出，呈現(xiàn)出老化成熟表型(CD11chiMHCⅠhiMHCⅡhiCD80mo)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力(圖1D～F)。如上說(shuō)明本法獲得的細(xì)胞為與mDC 類似的樹突狀細(xì)胞，但通常狀態(tài)下呈不成熟表型。

2.2 ED1、CD4、CD8 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 在預(yù)處理組紋狀體，CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)顯著低于對(duì)照組(134.7±36.2 vs 198.8±59.6，P＜0.01)，但CD8+細(xì)胞(145.8±45.4 vs 134.3±39.0，P＞0.05)及ED1+細(xì)胞(298.8±75.9 vs 302.2±88.5，P＞0.05)，二組間沒有明顯差別，提示esDCs 預(yù)處理主要對(duì)CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)產(chǎn)生影響(圖2)。

2.3 IL-10 與IFN-γ mRNA RT-PCR 半定量RTPCR 檢測(cè)缺血腦組織IL-10 與IFN-γ mRNA，預(yù)處理組與對(duì)照組缺血皮質(zhì)IL-10(1.147±0.260 vs 1.264±0.119，P ＞0.05)、IFN-γ(1.697±0.273 vs 1.829±0.250，P＞0.05)表達(dá)無(wú)顯著差異(圖3);提示esDCs預(yù)處理不改變?nèi)毖X組織局部炎性細(xì)胞因子水平。

2.4 NPC 存活率測(cè)定 NPC 移植之后2 周，進(jìn)行存活GFP 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。參與計(jì)數(shù)的腦片在注射點(diǎn)前后約±0.5 mm 之內(nèi)。兩組共收集符合要求的腦片52 張，計(jì)數(shù)每張腦片中10 個(gè)40×視野中GFP陽(yáng)性細(xì)胞，成團(tuán)細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞表示。統(tǒng)計(jì)結(jié)果示預(yù)處理組M=58.0(Qd=36.5，0～121)，對(duì)照組M=35(Qd=36.5，0～124)，U=209.5，Z=-2.353，P=0.019，兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

2.5 頸淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 移植兩周后取頸淋巴細(xì)胞與NPC 共培養(yǎng)，預(yù)處理組與對(duì)照組PI 值無(wú)顯著差別(1.245±0.211 vs 1.331±0.235，P ＞0.05)(圖5)。提示esDCs 預(yù)處理對(duì)NPCs 再刺激下頸淋巴細(xì)胞反應(yīng)無(wú)影響。

3 討論

目前認(rèn)為，干細(xì)胞及其衍生物比如NPCs 腦內(nèi)移植會(huì)引起局部免疫反應(yīng)，因此干細(xì)胞的移植有必要考慮克服移植排斥反應(yīng)［2，5］。在臨床移植中，通常運(yùn)用免疫抑制劑如環(huán)孢素A 來(lái)削弱免疫排斥反應(yīng)，這種方法的主要缺點(diǎn)是藥物的毒副作用大，因此移植免疫耐受策略一直頗受研究者重視，其中，以樹突狀細(xì)胞(DC)為平臺(tái)的免疫耐受策略是研究的焦點(diǎn)。研究證實(shí)，經(jīng)典樹突狀細(xì)胞如骨髓DC 及類漿細(xì)胞DC，具有捕獲和交叉遞呈外源抗原的能力，能用于誘導(dǎo)抗原特異性耐受［1］。在這種基本范例下，不成熟DC(imDC)表面MHC 分子及共刺激分子的低表達(dá)能誘導(dǎo)T 細(xì)胞耐受，相反成熟DC(mDC)高表達(dá)這些免疫分子從而激發(fā)效應(yīng)T 細(xì)胞。imDC 不管是供體的還是受者的，都可以增加致耐受性［6］。

esDC 是一種直接從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的樹突狀細(xì)胞，這種細(xì)胞在形態(tài)、表型、功能方面均與傳統(tǒng)髓源性imDC 相似，具備強(qiáng)大的抗原攝取提呈能力，但在缺乏足夠刺激因子的作用下總是處于穩(wěn)定的不成熟狀態(tài)(Immature status)，因而是很有前途的耐受性DC［3，4］。因此，本研究試圖建立一種全新的干細(xì)胞移植耐受誘導(dǎo)模式，即從同一ESCs 中分別誘導(dǎo)出治療性細(xì)胞如NPCs 和耐受性DC 如esDCs，然后將二者同時(shí)或先后注入受者體內(nèi)誘導(dǎo)完全意義上的耐受。這種模式的基本原理是利用imDC 的“致耐受性”以及與同源治療細(xì)胞的“表型同一性”，巧妙地將以前耐受誘導(dǎo)途徑中的“抗原同遞過程”消除。

本研究發(fā)現(xiàn)，esDC 預(yù)處理的大鼠，不能減少局部CD8+細(xì)胞和ED1+細(xì)胞的浸潤(rùn)，但能減少局部CD4+細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)增加移植細(xì)胞的存活率，提示esDC 可能通過減少局部CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)免疫耐受。據(jù)研究，NPCs 引起的腦內(nèi)免疫反應(yīng)模式主要為CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，可能與其表面MHCⅡ類分子在局部炎癥環(huán)境下表達(dá)上調(diào)有關(guān)［5，7，8］，因此，esDC 對(duì)CD4+T 細(xì)胞的抑制作用有助于移植物存活。據(jù)研究調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)在髓源性imDC 耐受誘導(dǎo)中起主要作用［1］。imDC 可以通過細(xì)胞-細(xì)胞途徑啟動(dòng)先天性CD4+CD25+Tregs，后者可以對(duì)活化的反應(yīng)性T 細(xì)胞“再教育”，通過“連鎖抑制”和“感染性耐受”等機(jī)制誘導(dǎo)T 細(xì)胞耐受［9，10］。imDC也可作用于誘導(dǎo)型CD4+CD25-Tregs(Tr1)，通過釋放“耐受性”細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β 等起免疫抑制作用［11，12］。據(jù)研究這兩種調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞歸巢部位不太一致，細(xì)胞因子依賴性CD4+CD25-Tr1 細(xì)胞傾向遷徙入炎癥地點(diǎn)如梗塞或移植部位，而自然發(fā)生CD4+CD25+Tregs 主要在淋巴器官中發(fā)現(xiàn)［9］，在本研究中，移植局部腦組織IL-10 抑制性細(xì)胞因子或刺激性細(xì)胞因子IFN-γ 等較對(duì)照組沒有明顯改變，提示Tr1 在esDCs 耐受誘導(dǎo)中可能不起主導(dǎo)作用，esDCs 誘導(dǎo)耐受作用是否與CD4+CD25+Tregs 有關(guān)，甚至是否主要通過“中樞”機(jī)制，即在受者胸腺模擬自身APCs 的陰性選擇機(jī)制克隆性刪除抗原特異性的T 細(xì)胞而起作用，有待進(jìn)一步研究。另外，本研究發(fā)現(xiàn)esDCs 預(yù)處理的大鼠局部淋巴細(xì)胞對(duì)NPCs 再刺激反應(yīng)與對(duì)照組無(wú)差別，可能主要與NPCs 體外環(huán)境下MHCⅡ類分子表達(dá)微弱有關(guān)［7，8］;也可能與耐受性DCs 來(lái)源有關(guān)，比如研究表明供者來(lái)源的DC 需通過受者DC 的間接提呈才能發(fā)揮耐受誘導(dǎo)作用［13］。

因此，本研究初步探討了esDCs 對(duì)同源性移植物的耐受誘導(dǎo)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)esDCs 可能通過減少局部CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)提高移植物的存活率，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究，比如需要相應(yīng)的細(xì)胞跟蹤實(shí)驗(yàn)明確esDC 在體內(nèi)的遷徙及存活狀態(tài)，同時(shí)需要對(duì)移植局部及引流淋巴結(jié)T 細(xì)胞進(jìn)行更細(xì)致的表型分型及與esDCs 的相互作用做深入探討。

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