方 琳 王軼楠 葛敬巖 劉海巖 李晨光 李繼茹 柳忠輝

(長春醫(yī)學高等?？茖W?；A醫(yī)學部，長春 130031)

激活素A(Activin A)屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員的多功能生長和分化因子［1，2］，具有多種生物學活性，可以維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活及保護神經(jīng)元免受神經(jīng)毒損傷作用［3-5］。我們先前的研究已經(jīng)證實激活素A 可以促進雞胚背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)突起生長和維持神經(jīng)元存活，而神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)也可以促進DRG 神經(jīng)突起生長和維持神經(jīng)元存活［6-8］，但是二者對DRG 神經(jīng)突起生長是否具有協(xié)同作用仍不清楚。本研究采用8 日齡的雞胚背根神經(jīng)節(jié)體外原代培養(yǎng)法，探討Activin A 對NGF 促進DRG 神經(jīng)突起生長及維持神經(jīng)元存活的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 8 日齡雞胚(購自長春市種雞廠)，3 次獨立試驗共用雞胚48 只。DMEM 培養(yǎng)基為GIBCO 公司產品，鼠神經(jīng)生長因子(NGF)購自武漢海特生物制藥股份有限公司，Activin A 來自R＆D公司。甲醇(HPLC 級)、乙腈(色譜純)、丙酮。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞胚神經(jīng)節(jié)的制備與培養(yǎng) 1 mg/ml 多聚賴氨酸，37℃包被培養(yǎng)2 h，0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3～4 次備用。取8 日齡的雞胚，按本室常規(guī)方法獲取雞胚背根神經(jīng)節(jié)［9，10］。在各椎孔處分別夾起神經(jīng)節(jié)，放于預先置有0.5%小牛血清(FCS)DMEM 培養(yǎng)液200 μl 的培養(yǎng)孔內，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。陰性對照組每孔加入0.5%小牛血清DMEM 培養(yǎng)液200 μl;NGF 組每孔加入終濃度4 ng/ml 的NGF;聯(lián)合實驗組，同時加入Activin A(5ng/ml)和NGF(4 ng/ml)。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，在顯微鏡下觀察DRG 神經(jīng)突起的生長狀態(tài)。

1.2.2 雞胚神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起的生長判定 用倒置顯微鏡觀察，通過統(tǒng)計學分析，比較不同組別的神經(jīng)突起數(shù)量和長度，因為第3 天的神經(jīng)突起生長明顯，所以我們在第3 天時對神經(jīng)突起的數(shù)量與長度進行判定。在各實驗組我們分別對每個神經(jīng)節(jié)選擇5 個最長的神經(jīng)突起計算平均值，以DRG 邊緣作為測量的起點，以神經(jīng)突起的最末端為測量的終點［11］。

1.2.3 雞胚神經(jīng)節(jié)細胞的制備與培養(yǎng) 按本室常規(guī)方法獲取雞胚背根神經(jīng)節(jié)細胞［9，10］。用0.5%小牛血清DMEM 培養(yǎng)液調整細胞濃度至6.5 ×104個/孔加入48 孔培養(yǎng)板。陰性對照組每孔加入0.5%小牛血清DMEM 培養(yǎng)液200 μl;NGF 組每孔加入終濃度4 ng/ml 的NGF;聯(lián)合實驗組，同時加入Activin A(5 ng/ml)和NGF(4 ng/ml)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d 換一次培養(yǎng)液。在第5 天時用倒置相差光學顯微鏡觀察神經(jīng)元生長情況。

1.2.4 雞胚DRG 細胞的活力測定 采用臺酚藍染色法，用血球計數(shù)板在高倍放大鏡下計數(shù)DRG 細胞中活細胞數(shù)量。尼氏小體是神經(jīng)元的特異標志，為了計算活細胞中神經(jīng)元的數(shù)量，用甲苯胺藍染尼氏小體。培養(yǎng)的DRG 細胞小片用PBS 洗3 次，每次5分鐘，加一滴1%甲苯胺藍染液，37℃孵育30 min，用蒸餾水洗一遍，最后中性樹脂封片。數(shù)200 個細胞中有尼氏小體陽性細胞數(shù)，神經(jīng)元數(shù)按以下公式計算。。

1.2.5 半定量PCR 48 孔板培養(yǎng)，每孔放40 個DRG，1 ml 預冷的PBS 洗1 次，加入TRIZOL 試劑1 ml 提取DRG 總RNA，紫外分光光度計測RNA 含量。CGRP 的正向引物5'-ctgcagcctggatagaccta-3'，反向引物5'-caggcacaaaaagagtctacg-3'。GAPDH 的正向引物5'-gtccaagtggtggccatcaa-3'，反向引物5'-gctgagggagctgagatgat-3'。二步法RT-PCR 擴增的特異cDNA片段，半定量PCR 反應總體積25 μl，cDNA 3 μl，10 ×PCR 緩沖液2.5 μl，dNTP Mix 1.5 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，加無菌雙蒸水至總體積25 μl。反應條件為預變性95℃，90 s，變性94℃，30 s，退火54℃，30 s，延伸72℃，1 min，共35 個循環(huán)，最后延伸72℃，10 min。以GAPDH 作為內參照半定量，各樣本表達強度=樣本灰度值/GAPDH 灰度值。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Pharmacia VDS 成像系統(tǒng)分析目的片段，采用GAPDH 作為內參照。

2 結果

2.1 Activin A 增強NGF 促進DRG 神經(jīng)突起生長 NGF 具有刺激DRG 神經(jīng)突起生長的作用，本研究聯(lián)合Activin A 與NGF 共同作用DRG 的結果顯示，0.5% FCS-DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)3 天的陰性對照組未見明顯DRG 神經(jīng)突起生長(圖1A)，NGF 4ng/ml 組突起生長較多(圖1B)，突起長度(123 ± 5.1)μm，聯(lián)合實驗組(Activin A 5 ng/ml +NGF 4 ng/ml)突起生長密且長(圖1C)，突起長度(151 ± 20.5)μm，與NGF 組比較差異顯著(圖2)，P＜0.05。上述資料提示Activin A 能夠增強NGF 促進DRG 神經(jīng)突起生長。

2.2 Activin A 增加NGF 維持的DRG 神經(jīng)細胞生存數(shù)量 DRG 神經(jīng)元在體外培養(yǎng)5 天，陰性對照組神經(jīng)元存活已極少(圖3A)，存活細胞數(shù)量為200 ±80 個細胞/孔，10 天時已無神經(jīng)元存活，但在培養(yǎng)10 天時，NGF 組(NGF 4ng/ml)仍有部分神經(jīng)元存活，形態(tài)良好，細胞數(shù)量(21 000 ±1 600)個細胞/孔(圖3B)，Activin A 5 ng/ml+NGF 4 ng/ml 聯(lián)合組在培養(yǎng)第10 天仍有大量神經(jīng)元存活，且有較長的神經(jīng)突起延伸(圖3C)，存活細胞數(shù)量為(32 000 ± 1 300)個細胞/孔(圖4)。上述資料提示Activin A 能明顯增加NGF 維持的DRG 神經(jīng)元存活數(shù)量。

圖1 激活素A 與NGF 聯(lián)合促進神經(jīng)突起生長(×200)Fig.1 DRG neurite outgrowth induced by activin A and NGF(×200)

圖2 每個神經(jīng)節(jié)突起數(shù)量、長度的比較Fig.2 Neurite count and neurite length of cultured DRG of chicken embryos were statistically analyzed

圖3 激活素A 與NGF 聯(lián)合維持神經(jīng)元生長(×100)Fig.3 Survival of embryonic DRG neurons cultured with activin A and NGF(×100)

圖4 DRG 神經(jīng)元生存時程活力曲線Fig.4 Time course of cell viability assay of cultured DRG neurons

2.3 Activin A 與NGF 聯(lián)合促進CGRP 表達 在探討ActivinA與NGF聯(lián)合作用時，我們通過計算各樣本表達強度，發(fā)現(xiàn)Activin A 與NGF 聯(lián)合誘導組比單純NGF 組更加顯著促進CGRP mRNA 的表達(圖5)。這些數(shù)據(jù)表明提示Activin A 與NGF 共同作用可能通過調控CGRP 表達，促進DRG 神經(jīng)元神經(jīng)突起生長和維持DRG 神經(jīng)元存活。

圖5 CGRP mRNA 表達Fig.5 CGRP mRNA expression

3 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)Activin A 在體外可以促進雞胚DRG 神經(jīng)突起的生長和長時間維持DRG 神經(jīng)元存活［9，12］。但是，Activin A 是否能與NGF 共同促進DRG 神經(jīng)元生長仍不清楚。為了分析Activin A對NGF 促進DRG 神經(jīng)元神經(jīng)突起生長的影響作用，本研究采用8 天的雞胚分離背根神經(jīng)節(jié)，原代培養(yǎng)法，觀察雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元神經(jīng)突起的體外生長情況。我們發(fā)現(xiàn)Activin A 與NGF 聯(lián)合作用比單一NGF 作用更加明顯刺激神經(jīng)節(jié)突起的生長，進一步采用原代培養(yǎng)法，發(fā)現(xiàn)Activin A 與NGF 聯(lián)合培養(yǎng)的DRG 神經(jīng)元存活也比單純NGF 組多。這些結果提示Activin A 與NGF 聯(lián)合作用比單純NGF 作用在維持神經(jīng)元功能上更有利。

許多研究證實CGRP 具有神經(jīng)保護功能［13］，并有助于軸突再生［14，15］。我們已經(jīng)知道外源性NGF也可以增加感覺神經(jīng)元CGRP 的表達［16-18］，Activin A 能夠增加NGF 在感覺神經(jīng)元上CGRP 的表達［19］。在探討Activin A 與NGF 的共同作用時，我們發(fā)現(xiàn)Activin A 與NGF 聯(lián)合誘導組比單純NGF 組更加顯著促進了DRG 的CGRP 表達。上述資料提示，Activin A 與NGF 可能共同上調CGRP 表達，進而促進DRG 神經(jīng)突起生長、維持DRG 神經(jīng)元存活。因此，二者的聯(lián)合應用可能為治療神經(jīng)元損傷及變性疾病的應用提供了新的數(shù)據(jù)和實驗依據(jù)。

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