魯明騫 孔慶志 許新華 盧宏達 盧忠心 譚 超 徐冰清 郭 蓉

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院腫瘤研究所＆湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤內科，宜昌 443003)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于我國南方各省，素有“廣東瘤”(Canton tumor)之稱，世界上80%的鼻咽癌發(fā)生在我國，占頭頸部惡性腫瘤的首位。各個年齡組均可發(fā)病，以30～60 歲多見，占75%～90%，男性發(fā)病為女性的(2～3.8)∶1。目前鼻咽癌的治療主要以放射治療為主，化療雖有較高的緩解率，但完全緩解率低，而且有較重的不良反應，新輔助化療及輔助化療對鼻咽癌患者生存率的影響尚無定論。分子靶向治療主要針對導致細胞癌變的環(huán)節(jié)，開創(chuàng)了腫瘤內科診斷和治療相結合的新時代，同時提高了患者的有效率及生存率。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其信號傳導存在于大多數(shù)細胞內，在其受到刺激后可將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，對細胞增殖、分化、轉化、凋亡、血管形成、腫瘤轉移等有一定調控效應［1］。MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4)是MAPK 的激酶，作為MAPK 信號傳導通路的構成部分，是Ras 癌基因信號傳導通路的中心環(huán)節(jié)，通過對細胞內、外信號刺激的調節(jié)作用，從而對腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡和轉移等有一定的調節(jié)作用［2］。本研究以鼻咽癌患者為研究對象，測定MKK4 蛋白的表達，研究其蛋白表達水平與鼻咽癌的相關性，初步探討鼻咽癌MKK 蛋白表達與生物學行為、侵襲轉移、治療、預后等的關系，希望通過本研究有助于對惡性腫瘤信號轉導機制的進一步了解，為鼻咽癌的預防與治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2002 年1 月至2009 年12 月鼻咽癌患者的石蠟組織標本90 例，其中男性62 例、女性28 例，年齡22～73 歲，平均(45.3±5.2)歲。鼻咽癌分期采用福州92 分期標準，其中低分化鱗癌85 例，未分化癌5 例，全部病人均為初診，行常規(guī)放射治療，中晚期病人輔以DDP+5-FU 誘導方案化療。收集同期病理結果為鼻咽慢性炎癥組織石蠟標本20 例作為對照組。所收集資料的內容主要為年齡、性別、淋巴結轉移、臨床分期、分化程度等。

1.2 試劑與方法 將石蠟包埋的組織標本制備成4 μm 厚的連續(xù)切片，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片，50℃恒溫箱烤片過夜，經(jīng)組織切片脫蠟、水化，滴加適量新鮮配制的3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min 以消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水洗3 min×3 次，PBS 緩沖液浸泡5 min。高溫高壓抗原修復:將切片置入0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液(PH6.0)中，高壓鍋加熱至噴汽1 min，自然冷卻后取出切片，蒸餾水洗3 min ×2 次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，滴加MKK4單克隆抗體(1∶80)，4℃過夜后在37℃復溫45 min，PBS 洗滌2 min ×3 次，滴加生物素化二抗，37℃20 min，PBS 洗滌2 min×3 次，滴加試劑SABC，37℃20 min，PBS 洗滌5 min×4 次，加DAB 顯色劑，顯色10 min，蘇木素輕度復染，0.5%鹽酸酒精分色、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3 結果判斷 MKK4 蛋白陽性信號定位于細胞質，少數(shù)位于細胞核，呈棕黃色。在400 倍光鏡下觀察每張切片，選取具有5 個代表性的不同視野進行觀察，根據(jù)MKK4 陽性細胞漿或細胞核的染色細胞陽性染色強度及陽性細胞數(shù)進行綜合分析評分:根據(jù)陽性染色強度進行半定量積分法判斷，將結果分為四個級別:0(Negative，無染色);1(Weak staining，弱陽性);2(Moderately increased staining，黃色);3(Intense staining，棕黃色者)。0 為光鏡下看不到明顯的染色結果;1 為染色散在單個細胞內或者是鱗狀上皮弱的擴散染色，染色為淺黃色者;2 為染色呈黃色，陽性結果主要出現(xiàn)在胞漿和/或細胞核;3 為染色呈棕黃色者，并且大面的出現(xiàn)在病灶部位。陽性細胞數(shù):無陽性細胞表達，計0 分;陽性表達細胞≤25%，計1 分;25%≤陽性細胞數(shù)≤50%，計2分;陽性表達細胞數(shù)＞50%，計3 分。上述兩種判斷標準得分乘積為最終計分結果:0 分為陰性;1、2、3、4、6、9 為陽性。最終結果由染色的總數(shù)和染色強度共同決定，總值0 表示陰性，0～2 為弱陽性，3～4 為中等陽性，6～9 為強陽性，≤2 為低表達，＞2 為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行分析處理。陽性率之間的比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 等級相關，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

免疫組化的切片均由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師閱片，評價主要是基于蛋白質表達的陽性細胞染色強度與陽性細胞數(shù)進行綜合評分。

2.1 MKK4 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽慢性炎癥組織的表達 免疫組化結果表明，MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中陽性表達率為75.6%(68/90)，鼻咽慢性炎癥組織中陽性表達率為95.5%(19/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，且鼻咽癌組的MKK4 蛋白的陰性細胞數(shù)(-)22 人，占24.4%，(+)為14 人，占15.6%，(++)為31 人，占34.4%，(+++)為23 人，占25.6%;對照組的MKK4 的陰性細胞數(shù)(-)1 人，占5.0%，(+)為3 人，占15.0%，(++)為6 人，占30.0%，(+++)為10 人，占50.0%，見表1。

表1 MKK4 在鼻咽癌及鼻咽慢性炎癥組織中的表達Tab.1 MKK4 expression in NPC and chronic nasopharyngitis tissues

2.2 鼻咽癌組織中MKK4 蛋白表達與臨床病理特征關系 MKK4 蛋白在低分化癌與未分化癌中的高陽性表達率分別為67.5%和0%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，T1-T2 鼻咽癌組織陽性高表達為51.3%(20/39)，在T3-T4 鼻咽癌組織中的陽性高表達為66.7%(34/51)，差異無統(tǒng)計學意義，(P ＞0.05)，無淋巴結轉移組織中細胞陽性高表達為76.7%(46/60)，有淋巴結轉移組織中細胞陽性高表達為26.7%(8/30)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，在臨床Ⅰ-Ⅱ期的陽性高表達為73.6%(39/53)，臨床Ⅲ-Ⅳ期的陽性高表達為40.5%(15/37)，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。MKK4 蛋白在男性鼻咽癌組織中高表達為53.2%(25/47)，在女性鼻咽癌組織中的高表達為67.4%(29/43)，年齡≥50 歲陽性高表達為64.5%(40/62)，年齡＜50歲陽性高表達50.0%(14/28)，病灶在咽隱窩陽性高表達為67.1%(47/70)，發(fā)生在頂后壁為35.0%(7/20)，結果顯示不同年齡、性別、原發(fā)部位、T 分期鼻咽癌組織中MKK4 高表達差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)(見表2)。

表2 MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中的表達與臨床病理特征的關系Tab.2 Relationship MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma and clinicopathological features

2.3 MKK4 蛋白表達與預后的關系 復發(fā)時間≤5年患者共28 例，MKK4 陽性高表達13 例(46.4%)，復發(fā)時間＞5 年共30 例，陽性高表達22 例(73.3%)(P ＜0.05)，提示MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中表達越高，TTP(5 年至疾病進展時間)越長。

3 討論

鼻咽癌是頭部最常見的惡性腫瘤，近年來鼻咽癌的發(fā)病呈逐漸上升趨勢，尤其是在我國的南方地區(qū)比較普遍，因此越來越受到人們的關注。面對常規(guī)的高強度治療效果不理想且副作用大的難題，針對細胞信號途徑的分子靶向藥物開創(chuàng)了腫瘤治療的新時代。

MAPK 是細胞信號傳導通路中常見的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其所涉及的4 條通路對于維持細胞的正常生理過程，尤其是細胞分裂和凋亡，具有重要的生物學意義［3］。當細胞生長和凋亡的平衡被打破時，就會導致腫瘤的發(fā)生甚至無限制生長。MKK4 主要分布在細胞質中，少數(shù)分布于細胞核。MKK4 作為MAPK 信號傳導通路的重要組成部分，是癌基因Ras 信號傳導通路的中心環(huán)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的調節(jié)作用［4］，能同時磷酸化并激活2 條MAPK 信號傳導通路，即JNK 通路和p38 通路，能將細胞外信號傳導至細胞及其核內，引起細胞生物學反應。本研究的結果表明，鼻咽癌患者中MKK4 蛋白的高表達率明顯低于鼻咽慢性炎癥組織中MKK4 蛋白高表達率，由此推測腫瘤細胞中可能存在MKK4 受體過度表達，通過信號級聯(lián)反應，使得細胞MKK4 生長受到抑制，出現(xiàn)腫瘤細胞失控性生長，證明MKK4 蛋白的高表達在一定程度上抑制了鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展。與對照組相比，鼻咽癌組的MKK4 蛋白的陽性表達率下調，隨著鼻咽癌的惡化，MKK4 蛋白的表達減少，且均與對照組有差異，但僅Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期有顯著性差異，而Ⅰ期、Ⅱ期的MKK4 蛋白表達水平最高，在鼻咽癌發(fā)展的過程中，MKK4 的表達呈現(xiàn)下降的趨勢，且Ⅲ期、Ⅳ期的表達水平最低。以上結果表明MKK4 蛋白的表達水平與鼻咽癌分期呈負相關。MKK4 蛋白在有淋巴結轉移、分化程度較差的組織中的高表達率明顯低于無淋巴結轉移、分化程度相對較好的組織，但不同年齡、性別、原發(fā)部位、T 分期并不影響MKK4 蛋白的陽性高表達率，無統(tǒng)計學差異。

MKK4 基因在腫瘤信號傳導中具有重要調節(jié)作用，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是具有正性還是負性調節(jié)作用目前還存在較大爭議。在本研究中，我們通過免疫組化方法測定鼻咽癌及鼻咽慢性炎癥組織中的MKK4 蛋白表達情況，結果顯示MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中的表達量明顯低于鼻咽慢性炎癥組織中的表達量，其原因可能是由于細胞微環(huán)境發(fā)生變化產生應激而使得MKK4-JNK 或/和MKK4-P38通路被激活。MKK4 蛋白在鼻咽癌組織中的高表達率明顯降低，說明MKK4 蛋白表達率下調可能是鼻咽癌發(fā)生的早期分子事件，甚至可能是始動因素之一，與劉斌等［5］研究結果一致。本研究顯示復發(fā)時間≤5 年患者MKK4 蛋白陽性高表達率明顯低于生存期＞5 年患者陽性表達率(P ＜0.05)，提示MKK4蛋白在鼻咽癌組織中表達越高，5 年至疾病進展時間(TTP)越長，與患者的預后有一定關系。Teng等［6］研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞株、乳腺癌細胞株、結腸癌細胞株和睪丸癌細胞株的MKK4 突變率約為3%，這些發(fā)現(xiàn)表明在某些癌細胞類型中MKK4 基因可能具有抑癌作用。Cunningham 等［7］發(fā)現(xiàn)胃癌患者手術切除胃腺癌標本中缺乏MKK4 蛋白表達的生存期較短，多變量研究分析顯示原發(fā)胃腺癌標本中MKK4 陰性的患者死亡危險性增加5 倍。Stark等［8］運用RT-PCR、免疫組化技術檢測乳腺導管癌及其腦部轉移灶中MKK4 基因及其蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)轉移灶與原發(fā)灶相比，MKK4 的表達下降達10倍，證明了MKK4 與乳腺癌腦轉移的負相關性。

但也有研究相反的結果，Wang 等［9］將缺乏內源性MKK4 的乳腺癌和胰腺癌細胞株轉染使其分別表達MKK4 基因，結果顯示癌細胞的增殖及侵襲能力得到提高。然而，通過RNA 干擾技術敲除MKK4 陽性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231 的MKK4基因后，結果導致癌細胞非停泊性生長速度下降。Wu 等［10］用免疫組化方法分析發(fā)現(xiàn)在胃腺癌組織中表達MKK4 蛋白的患者和胃腺癌組織中不表達MKK4 蛋白的患者相比，前者有較差的無復發(fā)生存率和總的生存期。此外，最近還有學者報道MKK4能通過激活核因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)而抑制細胞凋亡，但具體MKK4 是如何激活NF-κB 來抑制細胞凋亡的，其機制尚不清楚［11，12］。

為什么會存在這些自相矛盾的結果呢?主要原因可能為實驗時所采用的不同組織、細胞類型以及實驗模型的特異性所致。不同的腫瘤組織、相同腫瘤組織不同的發(fā)展階段，MKK4 的表達水平及其所誘導的生物學效應可能都具有組織特異性，從而導致了矛盾結果的出現(xiàn)。而且，在實驗時敲除細胞的MKK4 基因和細胞自然發(fā)生MKK4 基因丟失是不同的，實驗時MKK4 基因的丟失是實驗者強加于細胞的，而細胞自然發(fā)生的MKK4 基因丟失是基于細胞周圍自然環(huán)境選擇的結果。還有可能在不同的環(huán)境中檢測MKK4 的腫瘤抑制能力時，由于存在一些與轉移能力無關的影響因素，這些都可導致不同的結果［13］。

綜上所述，MKK4 蛋白的異常表達可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用?？捎肕KK4 蛋白的表達水平來預測患鼻咽癌的風險。因此，MKK4 可以作為一個潛在的判斷鼻咽癌發(fā)病與轉移的觀測指標，并可能為鼻咽癌的臨床治療提供新靶點。

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