孫曉晴，隗健凱，袁劍波，張曉軍??，李富花，相建海(. 中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室， 山東 青島 26607；2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 00049)

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凡納濱對蝦Hox基因及其在早期發(fā)育中表達模式的研究?

孫曉晴1,2，隗健凱1,2，袁劍波1，張曉軍1??，李富花1，相建海1
(1. 中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室， 山東 青島 266071；2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

Hox基因是決定動物形態(tài)多樣性的關(guān)鍵基因，同一類型Hox基因的同源異型結(jié)構(gòu)域(Homeodomain)序列及其功能在進化上高度保守。甲殼動物是僅次于昆蟲的第二大類節(jié)肢動物，但有關(guān)其Hox基因研究在深度和廣度上都遠遠不如昆蟲。本研究首先通過RNA-Seq測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中存在13種Hox基因，分別為Lvlab、Lvpb、Lvhox3、Lvdfd、Lvscr、Lvftz、Lvantp、Lvubx、LvabdA、LvabdB、Lvmsx、Lvmnx和Lvdll；然后根據(jù)RNA-Seq數(shù)據(jù)，克隆獲得了這13條基因的開放閱讀框(ORF)的cDNA序列，并對其序列結(jié)構(gòu)、早期發(fā)育表達模式及同源關(guān)系進行了初步分析。序列分析顯示這些Hox基因的結(jié)構(gòu)非常保守，同源比對顯示同一類型的Hox基因的氨基酸序列在不同物種之間具有較高的保守性；表達模式分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同Hox基因在早期發(fā)育過程中的表達模式不同，從囊胚期開始，按時序表達的先后順序基本為Lvmsx、Lvlab、Lvpb、Lvhox3、Lvdfd、Lvscr、Lvftz、Lvmnx、Lvdll、Lvantp、Lvubx、LvabdA、LvabdB。根據(jù)各Hox基因表達時期對應(yīng)的對蝦胚胎和幼體發(fā)育情況，初步推測了這些基因在凡納濱對蝦的發(fā)育過程中可能的功能。

Hox基因；凡納濱對蝦；甲殼動物；早期發(fā)育；表達模式

Hox基因是后生動物中普遍存在的一類含有同源框(Homeobox)的基因，它們都具有一段約180 bp的可轉(zhuǎn)錄出約60個氨基酸的同源異型結(jié)構(gòu)域(Homeodomain)保守蛋白的序列。這類基因在基因組上成簇存在，同一類型Hox基因在進化上高度保守。Hox基因調(diào)控生物體軸形成，參與動物早期胚胎發(fā)育，它編碼的Homeodomain蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過與靶基因序列特異結(jié)合而實現(xiàn)對生物發(fā)育的調(diào)控[1-2]。1984年，Hox基因在果蠅(Drosophilamelanogaster)中首次被發(fā)現(xiàn)[3-4]，逐漸成為人們研究生物體形態(tài)進化的焦點。Hox基因若發(fā)生突變，則會產(chǎn)生同源異型表型，即同源異型突變。例如果蠅的BX-C基因簇中的Ubx發(fā)生突變后，第三胸節(jié)可變?yōu)榕c第2胸節(jié)類似的結(jié)構(gòu)，原有的平衡棒被一對小翅所代替，這就是著名的果蠅雙胸突變體[5]。因此，通過調(diào)控Hox基因的轉(zhuǎn)錄表達，可以達到控制生物形態(tài)發(fā)育的目的，這對研究生物體的形態(tài)發(fā)育和進化有重要意義。

根據(jù)大量節(jié)肢動物的Hox基因序列以及表達模式的研究報道，現(xiàn)在普遍認為節(jié)肢動物一套完整的Hox基因簇(Hoxgene clusters)可能由laial(lab)、proboscipedia(pb)、Hox3/zen、Deformed(Dfd)、Sexcombsreduced(Scr)、fushitarazu(ftz)、Antennapedia(Antp)、Ultrabithorax(Ubx)、abdominal-A(abdA) 和Abdominal-B(abdB) 10個基因所組成[6-8]。幾乎所有的節(jié)肢動物都具有這一套Hox基因簇，這些基因之間通過復(fù)雜的相互作用造就了節(jié)肢動物的形態(tài)多樣性。目前，在節(jié)肢動物中，有關(guān)Hox基因的研究大量集中于昆蟲，特別是果蠅的Hox基因結(jié)構(gòu)和功能研究已經(jīng)非常深入，各Hox基因的功能和表達調(diào)控已經(jīng)基本清楚。然而在甲殼動物中，Hox基因的研究還很缺乏。雖然甲殼動物與昆蟲同屬節(jié)肢動物門，但是它們的形態(tài)特征、遺傳發(fā)育及生活習(xí)性有著非常大的差異，因此盡管它們共用一套同源的Hox基因來調(diào)控形態(tài)發(fā)育，但是Hox基因間的調(diào)控表達方式卻很可能大不相同，從而在不同的體節(jié)產(chǎn)生不同功能的附肢來適應(yīng)不同的生活環(huán)境。在甲殼動物的代表種類-對蝦中，目前尚無有關(guān)Hox基因的報道。

對蝦的發(fā)育過程與果蠅等昆蟲及其他節(jié)肢動物有很大的不同，屬于增節(jié)變態(tài)發(fā)育。在無節(jié)幼體階段身體是不分節(jié)的，但已開始頭胸發(fā)育并產(chǎn)生3對附肢；從無節(jié)幼體后期開始腹部出現(xiàn)分節(jié)；至溞狀幼體和糠蝦幼體，初期的3對附肢逐漸演變成口器、觸角等器官，體節(jié)增多，身體變長并伴隨著附肢的增長和功能分化(例如胸部附肢稱為步足，行使行走功能；腹部附肢稱為游泳足，行使游動功能)，同時在發(fā)育過程中一直伴隨著蛻皮現(xiàn)象[9]。對蝦類的體節(jié)發(fā)育方式復(fù)雜，相關(guān)研究很少。本研究選擇凡納濱對蝦(L.vannamei)為實驗材料，通過用生物信息學(xué)方法對其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析篩選，對相關(guān)Hox基因的開放閱讀框的cDNA序列進行分析和克隆驗證，同時與果蠅的Hox基因進行比對分析，并初步分析這些基因在對蝦早期發(fā)育中的表達模式，以便嘗試了解Hox基因在對蝦類發(fā)育過程中的作用。這些研究將豐富甲殼動物Hox基因研究，為對蝦形態(tài)發(fā)育和進化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1Hox基因序列的獲得和生物信息學(xué)分析

在前期研究中，本課題組開展了凡納濱對蝦不同發(fā)育時期(胚胎、無節(jié)幼體、溞狀幼體、糠蝦幼體和仔蝦)的RNA-Seq測序，共得到約26 Gb轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)組裝得到66 815條單基因簇(Unigenes)[10]。從Fruitfly Base(http://flybase.org/)中下載了果蠅的2個Hox基因簇ANT-C和BX-C共8個Hox基因(lab、pb、Dfd、Scr、Antp、Ubx、abdA和abdB)的cDNA全長序列，將這些序列與凡納濱對蝦的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRR1039534)進行比對，得到同源序列數(shù)據(jù)。同時對轉(zhuǎn)錄組組裝得到的Unigenes或Transcripts(轉(zhuǎn)錄本)進行篩選，收集注釋為Hox基因的序列。將2方面得到的數(shù)據(jù)合并后進行分類和篩選，然后將得到的序列在NCBI去冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Nr)中進行BlastX比對檢索，對候選Hox基因序列進行精確分類，找出各自編碼區(qū)和編碼同源異型結(jié)構(gòu)域區(qū)，并進行序列間的比對以及與果蠅各Hox基因的比對分析。

1.2 PCR克隆驗證

由于不同的Hox基因表達的時期不一樣，根據(jù)RNA-seq結(jié)果，選擇凡納濱對蝦多個Hox基因集中表達的無節(jié)幼體、溞狀幼體和糠蝦幼體3個發(fā)育時期的樣品，按照北京全式金生物技術(shù)公司的TransZol Up方法提取3個樣品的總RNA。以3種總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

對篩選得到的各Hox基因序列，用primer 5.0軟件設(shè)計系列引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。對于一個基因有多個Transcripts的情況，選取序列最長或包含同源異型結(jié)構(gòu)域區(qū)最完整的一條轉(zhuǎn)錄本設(shè)計引物。

以制備的凡納濱對蝦的3種cDNA為模板，進行PCR擴增，獲取不同的Hox基因cDNA片段。PCR反應(yīng)體系為25μL：2×PCR Mix 12.5μL，模板cDNA 1μL，4μmol/L正向引物1μL，4μmol/L反向引物1μL，DNA Taq polymerase 0.25μL，ddH2O 9.25μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃變性5min；95℃變性30s，退火(溫度因引物而異)30s，72℃延伸45s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后將產(chǎn)物片段純化克隆并送到上海桑尼生物科技公司測序，得到的序列與轉(zhuǎn)錄組序列進行比對驗證。

1.3Hox基因在早期發(fā)育中表達模式

根據(jù)本課題組的凡納濱對蝦20個不同早期發(fā)育時期的表達譜RNA-Seq測序數(shù)據(jù)[10]，對經(jīng)篩選鑒定的Hox基因序列在不同的早期發(fā)育時期的數(shù)據(jù)中進行檢索，獲得不同時期各Hox基因的表達量信息，并繪制熱圖進行聚類分析。根據(jù)各基因的表達量變化，結(jié)合對應(yīng)的對蝦胚胎和幼體發(fā)育時期的特征，分析各Hox基因在凡納濱對蝦早期發(fā)育中的表達模式及可能具有的功能。

2 結(jié)果與討論

2.1Hox基因序列

在凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組中，共篩選得到27條Unigenes或Transcripts與Hox基因相關(guān)(見表1)。經(jīng)過BlastX比對進一步分類和分析，這27條Unigenes或Transcripts序列歸結(jié)到13條Hox基因，分別是Lvlab、Lvpb、Lvhox3、Lvdfd、Lvscr、Lvftz、Lvantp、Lvubx、LvabdALvabdB、Lvmsx、Lvmnx和Lvdll。其中Lvlab、Lvpb、Lvdfd、Lvscr、Lvftz、Lvantp、Lvubx、LvabdA、LvabdB、Lvmsx和Lvdll擁有完整的ORF，BlastX比對覆蓋了整個Homoedomain區(qū)域；其余的Hox基因序列都只包含部分ORF，經(jīng)BlastX比對后發(fā)現(xiàn)，這些部分編碼區(qū)覆蓋不同Hox基因的全部或部分Homoedomain區(qū)域。

對13條Hox基因序列設(shè)計引物，PCR擴增得到目的片段，產(chǎn)物經(jīng)克隆測序驗證，各序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的原始序列保持一致(所有13條序列均已上傳至NCBI，可能存在多個轉(zhuǎn)錄本的基因，選擇包含生物信息最多的一條上傳)(見表1)。

2.2Hox基因序列分析

將凡納濱對蝦的13條Hox基因的蛋白序列進行比對和結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Hox基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)主要由一個含YPWM的Motif(基序)(或者類似的4個氨基酸Motif)和一個高度保守的Homeodomain組成，并且不同類型的Hox基因序列的Homeodomain區(qū)域具有一定的相似性(見圖1)。這說明不同類型的Hox基因可能來源于同一祖先，經(jīng)過漫長的進化，逐漸在某些關(guān)鍵的氨基酸部位發(fā)生突變從而獲得新的功能變成新的基因。很多Hox基因的作用因子通過與YPWM motif的結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用。有研究認為，Hox3和ftz的Hox功能逐漸缺失與YPWM基序的丟失和突變有關(guān)[6]，凡納濱對蝦的Hox基因大多含有這個基序或者類似的4個氨基酸序列，這可能與不同Hox基因發(fā)揮不同的功能作用密切相關(guān)，其中Lvhox3和Lvftz這2個基因缺失這種基序或者序列已經(jīng)發(fā)生了很大的變化，其Hox功能是否同樣缺失或改變將在下文討論。

在NCBI中下載與這13條凡納濱對蝦Hox基因序列同源的果蠅Hox基因序列。經(jīng)過比對，發(fā)現(xiàn)雖然凡納濱對蝦與果蠅在進化上的親緣關(guān)系甚遠，但是Hox基因的序列及結(jié)構(gòu)保守程度非常高。其中2個物種的Hox3和ftz的序列相似度較低，尤其是凡納濱對蝦的Hox3與果蠅的由Hox3衍生的3個基因zen、zen2和bicoid相比，氨基酸序列的相似度逐步降低。在果蠅中，Hox3衍生的3個基因序列的YPWM Motif已經(jīng)丟失，并且Homeodomain序列的改變很大，而ftz雖然Homeodomain序列仍舊很保守但已經(jīng)丟失了YPWM序列，可見導(dǎo)致這2個基因完全丟失Hox基因調(diào)控體節(jié)發(fā)育功能的原因可能是由上文提到的YPWM Motif丟失引起[6]。

表1 凡納濱對蝦Hox基因信息

圖1 凡納濱對蝦13條Hox基因的蛋白序列的同源性比對Fig.1 The similarity analysis of 13 Hox protein sequence of L. vannamei

(D.m：黑腹果蠅；L.v：凡納濱對蝦。D.m: D.melanogaster; L.v: L.vannamei)圖2 凡納濱對蝦13條Hox基因的蛋白序列與果蠅的同源性比對Fig.2 Compare the homology of Hox protein sequences in D.melanogaster and L.vannamei

2.3Hox基因在凡納濱對蝦幼體不同時期中的表達

根據(jù)凡納濱對蝦幼體不同發(fā)育時期的表達譜RNA-Seq數(shù)據(jù)，將注釋為Hox基因的Unigenes或Transcripts進行聚類分析，相似表達形式的Unigenes或Transcripts聚類到一個模塊中。見圖3，從這個熱圖可以看出不同的Unigenes或Transcripts在不同時期的表達水平各不相同，但總體看來，Lvlab、Lvpb、Lvhox3、Lvdfd、Lvftz、Lvmsx、Lvdll和Lvmnx主要在無節(jié)幼體及之前的時期表達活躍，Lvscr、Lvantp、Lvubx、LvabdA和LvadB則在溞狀幼體及之后的時期活躍表達。

2.4 對凡納濱對蝦Hox基因功能的推測

由于Hox基因是一類高度保守的基因，因此可以通過同一類型的Hox基因在其他節(jié)肢動物種類中的作用和該基因在凡納濱對蝦發(fā)育過程中高表達時期對應(yīng)的發(fā)育特征推測Hox基因在凡納濱對蝦的發(fā)育過程中的功能。

從圖3中可以看出，凡納濱對蝦在受精卵處于囊胚以前的時期，所有的Hox基因基本都沒有表達或者非常低量表達；從囊胚期開始隨著細胞分化而開始陸續(xù)表達Hox基因。

(左面：聚類結(jié)果；右面：Hox基因的表達譜數(shù)據(jù)；上面：不同的發(fā)育時期，由左到右依次是：zygo(受精卵)，C2(2細胞期)，C4(4細胞期)，C32(32細胞期)，blas(囊胚期)，gast(原腸胚期)，Lbe1(肢芽早期)，Lbe2(肢芽晚期)，Lim1(膜內(nèi)無節(jié)幼體早期)，Lim2(膜內(nèi)無節(jié)幼體晚期)，N1(無節(jié)幼體1期)，N3(無節(jié)幼體3期)，N6(無節(jié)幼體6期)，Z1(溞狀幼體1期)，Z2(溞狀幼體2期)，Z3(溞狀幼體3期)，M1(糠蝦幼體1期)，M2(糠蝦幼體2期)，M3(糠蝦幼體3期)，P1(仔蝦1期)。Left: The result of cluster analysis; Right: Expression level ofHoxgenes; Up: Different developmental stage ofL.vannamei, from the left to right: zygote, 2 cells, 4 cells, 32cells, blastula, gastrulae, limb bud 1, limb bud 2, nauplius in membrane 1, nauplius in membrane 2, Nauplius 1, Nauplius 3, Nauplius 6, Zoeae 1, Zoeae 2, Zoeae 3, Mysis 1, Mysis 2, Mysis 3,Post-larva 1.)

圖3 凡納濱對蝦Hox基因在不同發(fā)育時期的表達譜
Fig.3 TheHoxgenes expression profiling ofL.vannameiin different developmental stages

從肢芽早期到膜內(nèi)無節(jié)幼體晚期，凡納濱對蝦先后出現(xiàn)3對附肢：第一觸角、第二觸角和大顎，并且在胚體前端的腹面中央出現(xiàn)紅褐色的單眼[9]。在這期間，Lvlab、Lvhox3、Lvmsx、Lvdfd、Lvftz、Lvmnx和Lvdll7個基因先后開始表達，表達量先升高再降低。Lvlab、Lvdfd和Lvmsx3個基因的表達趨勢一致，而Lvhox3的表達則表現(xiàn)為與其相反的趨勢。Lvftz與Lvdfd同時在膜內(nèi)無節(jié)幼體開始表達，但表達量上調(diào)和下調(diào)的變化很大。Lvmnx和Lvdll開始表達的時期較晚，且表達量一直不高，但表達時期延伸到了后面的溞狀幼體1期(見圖4a～f)。因此，推測Lvlab、Lvmsx、Lvhox3、Lvdfd和Lvftz可能參與調(diào)控凡納濱對蝦觸角、大顎和單眼的發(fā)育，Lvdll和Lvmnx可能與3對附肢的后期發(fā)育有關(guān)，并且參與無節(jié)幼體期附肢的細節(jié)特征和功能分化。對蝦無節(jié)幼體期分為6個時期，主要特征是軀體增大，3對附肢相應(yīng)增長增大，細節(jié)特征增多，到無節(jié)幼體期6期，出現(xiàn)頭胸甲、2對小顎和2對顎足，腹部出現(xiàn)多對附肢原基，口器和消化器官逐漸形成[9]。Hox基因的表達表現(xiàn)為孵化前期高表達的基因如Lvlab、Lvmsx、Lvhox3和Lvftz等開始低量表達或者不表達，而另外一些Hox基因，如Lvpb、Lvscr、Lvantp開始上調(diào)表達，推測Lvpb、Lvscr、Lvantp可能主要參與口器和消化器官的發(fā)育形成，并且Lvdll和Lvmnx可能也起到重要的調(diào)控作用。

至溞狀幼體時期具完整的口器和消化器官，身體開始分節(jié)并且在胸節(jié)長出附肢[9]。從Hox基因的表達上可以看出，Ubx、LvabdA、LvabdB開始表達。

凡納濱對蝦在糠蝦幼體至仔蝦時期已具有全部的體節(jié)和附肢，且各附肢的細節(jié)特征逐步得到完善。這段時期主要表達LabdA、LvabdB3個基因(見圖4g～p)。這3個基因之間LvabdA和Lvubx的表達趨勢一致并且同LvabdB的表達趨勢相反，呈此消彼長的變化規(guī)律，推測這3個基因之間相互作用共同調(diào)節(jié)和完善凡納濱對蝦胸腹節(jié)及其附肢的發(fā)育。

2.4.1Lvlab在節(jié)肢動物Hox基因的研究中，lab總是最先表達的一個基因[6-7]。在果蠅幼體期，lab與觸角、視葉原基、中腸和部分由腦發(fā)出的神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)；成體時表達則僅限于眼部、觸角及其他頭部區(qū)域的發(fā)育[11]。在甲殼動物球鼠婦(Porcelliolaevis)中，lab僅在第二對觸角表達，調(diào)控觸角發(fā)育[12]。Lvlab主要在凡納濱對蝦肢芽早期開始大量表達，在膜內(nèi)無節(jié)幼體晚期迅速下降，以后表達量一直很低。推測Lvlab在凡納濱對蝦發(fā)育過程中的作用至少有一點與其他節(jié)肢動物相同，就是與觸角的發(fā)育密切相關(guān)。

2.4.2Lvhox3和lvftzHox3和ftz都是非常古老的Hox基因之一，在生物漫長的進化史中，這2個基因的序列、表達區(qū)域以及功能都發(fā)生了改變。在蜈蚣和蜘蛛等多足類和螯肢類動物中，這2個基因仍具有Hox基因的功能，參與顎的發(fā)育[6]；在果蠅等昆蟲中，這2個基因經(jīng)過復(fù)雜的進化歷史，已經(jīng)丟失了Hox-like功能，而分別在胚外組織和神經(jīng)元中獲得了不同的新的功能[6]。在甲殼動物中，這2個基因在水溞(Daphniapulex)胚胎發(fā)育的不同時期表達位置不同，最終在大顎節(jié)或大顎節(jié)后部表達，因此研究者認為ftz和Hox3在水溞中仍具有Hox基因功能[13]；球鼠婦中Hox3僅在大顎肢芽中心表達[8]，藤壺(Sacculinacarcini)中，ftz僅在神經(jīng)系統(tǒng)表達[14]。在凡納濱對蝦中，Lvhox3在囊胚期迅速大量增加，原腸胚表達量達到最大后迅速下降，在其他時期的表達水平都較低。Lvftz從原腸胚期開始表達，在肢芽期達到最大量表達，無節(jié)幼體時期及之后微量表達或不表達。推測，既然這2個基因在凡納濱對蝦胚胎早期、變態(tài)發(fā)育開始發(fā)生前大量表達，就可能仍具有Hox基因調(diào)控動物形態(tài)發(fā)育的功能，至于具體調(diào)控胚胎和幼體的哪一部分發(fā)育，以及是否具有調(diào)其他新功能，還有待深入研究。

(每圖縱坐標(biāo)代表Hox基因的表達量，橫坐標(biāo)是不同的Hox基因，由左到右依次是:Lvlab、Lvpb、Lvhox3、Lvdfd、Lvscr、Lvftz、Lvmsx、Lvdll、Lvmnx、Lvantp、Lvubx、LvabdA、LvabdB。A～p分別是凡納濱對蝦不同的發(fā)育時期各Hox基因的表達情況：a.囊胚期，b.原腸胚期，c.肢芽早期，d. 肢芽晚期，e. 膜內(nèi)無節(jié)幼體早期，f.膜內(nèi)無節(jié)幼體晚期，g. 無節(jié)幼體1期，h. 無節(jié)幼體3期，i.無節(jié)幼體6期，j.溞狀幼體1期，k. 溞狀幼體2期，l.溞狀幼體3期，m.糠蝦幼體1期，n.糠蝦幼體2期，o.糠蝦幼體3期，p.仔蝦1期。Ordinate: Expression level ofHoxgenes; Abscissa: 13Hoxgene, from the left to right:Lvlab,Lvpb,Lvhox3,Lvdfd,Lvscr,Lvftz,Lvmsx,lvdll,Lvmnx,Lvantp,Lvubx,LvabdA,LvabdB, a～p showed different development stage ofL.vannamei: a. blastula, b. gastrulae, c. limb bud 1, d. limb bud 2, e. nauplius in membrane 1, f. nauplius in membrane 2, g. Nauplius 1, h. Nauplius 3, i. Nauplius 6, j. Zoea 1, k. Zoea 2, l. Zoea 3, m. Mysis 1, n. Mysis 2, o. Mysis 3, p. Post-larva 1.)

圖4 凡納濱對蝦胚胎及幼體發(fā)育的時期各Hox基因的表達變化
Fig.4 The dynamic expressions of 13Hoxgenes in difference early development stage ofL.vannamei

2.4.3LvMsxMsx從腔腸動物到哺乳動物均有表達，是一類高度保守的Hox基因。無脊椎動物只有單一的MSH/MSX，對背腹中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成起著至關(guān)重要的作用，該功能在進化上高度保守[15-17]。凡納濱對蝦的Lvmsx從受精卵即出現(xiàn)，至原腸胚時期開始大量表達，幾乎覆蓋隨后的所有發(fā)育時期，而高度表達時期主要集中在肢芽期到膜內(nèi)無節(jié)幼體時期，根據(jù)前期文獻，推測在Lvmsx的功能很多，可能對凡納濱對蝦的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。在凡納濱對蝦中，疑似存在多個Lvmsx轉(zhuǎn)錄本，推測不同的轉(zhuǎn)錄本作為不同的轉(zhuǎn)錄因子或信號分子調(diào)控不同部分的神經(jīng)發(fā)育[18]。

2.4.4Lvdfd有研究發(fā)現(xiàn)在球鼠婦中，Dfd僅在大顎節(jié)和小顎節(jié)表達，但是在大顎節(jié)中心受到抑制，而這個區(qū)域正是Hox3表達位置，因此推測Lvdfd受Hox3的表達抑制[12]。在凡納濱對蝦中，Lvdfd從原腸胚期開始連續(xù)表達，在膜內(nèi)無節(jié)幼體早期達到最大后開始迅速下降，之后低量表達。在此期間形成的無節(jié)幼體的身體將來主要發(fā)育為對蝦的頭部，因此推測，Lvdfd的功能可能是負責(zé)頭部大小顎的形成發(fā)育。結(jié)合Lvhox3的表達趨勢及其在鼠婦中的作用，凡納濱對蝦中Lvdfd和lvhox3之間可能也存在著相互抑制的作用，共同調(diào)控大顎小顎的發(fā)育。

2.4.5LvdllDll在節(jié)肢動物中的最主要最普遍的功能是調(diào)控附肢的發(fā)育[6]。在昆蟲中，Dll在腹部的附肢發(fā)育時表達受到Ubx/abdA的抑制而使腹部無附肢[19-20]；而在多足綱和甲殼綱動物中，Dll在腹部的表達和及其對附肢的調(diào)控并不受Ubx或abdA抑制[21]。在果蠅中，Dll第二個功能還與觸角的發(fā)育密切相關(guān)，由于果蠅的觸角具有聽覺和嗅覺的功能，研究證實，Dll還與嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)[22-23]。Lvdll在凡納濱對蝦肢芽早期表達迅速上調(diào)，膜內(nèi)無節(jié)幼體早期達到最大量表達，之后表達量迅速下降，到溞狀幼體時期以后一直微量表達。推測Lvdll主要參與調(diào)控凡納濱對蝦早期3對附肢的發(fā)育，可能遠程調(diào)控胸腹部附肢的形成，由于胸部和腹部分別是功能分明的步足和游泳足，因此Lvdll的表達并不受完全Ubx或LvabdA的抑制，更有可能是一起共表達調(diào)控胸腹部附肢的發(fā)育，決定附肢的種類和功能。

2.4.6LvmnxMnx在人類基因中被稱為HB9或HLXB9，對哺乳動物的胰腺發(fā)育和運動神經(jīng)元的分化合并至關(guān)重要，突變可導(dǎo)致Currarino綜合征[24]。無脊椎動物雖然缺乏胰腺，但是在原始的胚胎內(nèi)胚層仍有該基因的表達[25]。在果蠅中，Mnx還是運動神經(jīng)細胞遷移、軸突生長和決定運動神經(jīng)元亞型種類所必需的調(diào)控因子。在凡納濱對蝦中，Lvmnx從肢芽早期開始有微量表達，在整個胚胎及胚后發(fā)育時期的表達量一直很低。推測Lvmnx在凡納濱對蝦中的功能有2種可能，一種是促進組織肝胰臟的發(fā)育，另一種可能與運動神經(jīng)的發(fā)育分化密切相關(guān)。

2.4.7Lvpbpb在是昆蟲特化結(jié)構(gòu)唇顎發(fā)育的重要調(diào)控基因。在果蠅中主要在胚胎和成體的唇節(jié)顎節(jié)表達，并且分別與Dfd和Scr相互結(jié)合作用決定成體果蠅顎須和唇的特化[26]；在螯肢類和多足類動物中，Lvpb在從大小顎到步足都有表達[6]；而在球鼠婦中僅在第二觸角表達[12]。Lvpb在凡納濱對蝦膜內(nèi)無節(jié)幼體早期開始表達，這正是口形成的時期，但Lvpb一直到仔蝦所有表達時期的有表達，只是表達量都很低。推測Lvpb可能與對蝦口器的發(fā)育密切相關(guān)，但很可能還有其他的功能。

2.4.8LvscrScr在不同的節(jié)肢動物中的表達區(qū)域不一樣，且功能呈現(xiàn)多樣化。在果蠅中，可誘導(dǎo)唾液腺的發(fā)育，在家蠶中誘導(dǎo)絲腺和唾液腺的發(fā)育，在其他昆蟲的一些特化附肢中也具有重要作用[6]。在馬利筋長蝽(Oncopeltusfasciatus)中，Scr與pb共同作用決定唇的發(fā)育，與Dfd共同作用決定小顎的發(fā)育[27]。在甲殼動物中，Scr與Ubx相互作用調(diào)控顎肢的發(fā)育，兩者動態(tài)表達產(chǎn)生不同的顎肢[7]，如在球鼠婦和克原氏螯蝦(Procambarusclarkii)中，Scr在早期胚胎發(fā)育的第一對小顎中表達[28-29]。在凡納濱對蝦中，Lvscr主要在無節(jié)幼體時期和溞狀幼體早期表達，表達趨勢與Lvpb的表達一致。由于在果蠅等昆蟲中Scr對pb具有活化的正調(diào)控作用，推測Lvscr可能與Lvpb共同作用協(xié)調(diào)表達調(diào)控對蝦口器顎的發(fā)育。

2.4.9LvantpLvantp已在3種甲殼動物中研究報道：在鹵蟲(Artemiafranciscan)中，Lvantp表達區(qū)域從第一對小顎節(jié)后部開始延伸到全部胸節(jié)[29]；在球鼠婦中則從第二對小顎節(jié)開始延伸到整個胸部[30]；在克原氏螯蝦中，Antp的表達在腹部的表達較弱，在第二對小顎節(jié)附肢和3對螯肢中最強[28]。因此，Antp主要參與決定甲殼動物小顎和胸部附肢的發(fā)育。在凡納濱對蝦中，Antp在無節(jié)幼體時期表達量開始快速增加，至溞狀幼體時期開始下降并趨于穩(wěn)定低量表達。凡納濱對蝦自無節(jié)幼體時期末期開始出現(xiàn)多對附肢和頭胸甲，在溞狀幼體時期開始分節(jié)并且胸節(jié)長出附肢。由此推測lvantp主要參與調(diào)控凡納濱對蝦小顎、胸節(jié)及其附肢的發(fā)育。

2.4.10Lvubx在果蠅中，Ubx決定后部胸節(jié)和腹節(jié)發(fā)育，Ubx還通過抑制Dll的表達抑制腹部附肢的發(fā)育[19-20]。在鹵蟲中，Ubx/abdA的表達與胸腹部附肢的形態(tài)發(fā)育關(guān)系密切，Ubx/abdA在不同物種間的動態(tài)表達，誘導(dǎo)決定了各對附肢的功能，例如捕食、游泳、爬行或戰(zhàn)斗[31]。在凡納濱對蝦中，Lvubx從無節(jié)幼體時期開始一直到糠蝦幼體和仔蝦時期都有表達，這段時間主要發(fā)生增節(jié)變態(tài)發(fā)育，出現(xiàn)胸節(jié)和腹節(jié)及附肢并且各附肢的分工明確。因此，推測Lvubx在凡納濱對蝦中的功能作用主要是與LvabdA和LvabdB共同作用在胸腹部決定體節(jié)和附肢的形態(tài)發(fā)育。

2.4.11LvabdAabdA在節(jié)肢動物中的主要功能作用是調(diào)節(jié)腹部附肢的發(fā)育。abdA在已研究的3種甲殼動物表達各異：在鹵蟲中，自第二胸節(jié)的神經(jīng)節(jié)開始表達，覆蓋整個胸部，與Ubx的表達區(qū)域重疊[29]；在球鼠婦中，abdA在腹部表達跟Ubx表達區(qū)域無重疊[30]；在克原氏螯蝦胚胎發(fā)育后期，abdA與Ubx表達位置大多無重疊[28]，因此導(dǎo)致這3種甲殼動物的胸腹部附肢形態(tài)各異。凡納濱對蝦的lvabdA在無節(jié)幼體時期開始連續(xù)表達，呈上調(diào)趨勢，在糠蝦幼體時期開始穩(wěn)定表達，但表達量不高。表達趨勢同Lvubx的表達呈現(xiàn)一致，推測LvabdA與Lvubx基因相互作用共同調(diào)控對蝦胸部和腹部體節(jié)及附肢的發(fā)育。

2.4.12LvabdB在昆蟲發(fā)育的過程中，AbdB不論在基因簇上的位置還是表達時間先后順序都是最后一個，決定昆蟲腹部后部體節(jié)和生殖腺的發(fā)育[7]。而在鹵蟲中AbdB基因只在位于胸節(jié)后部腹節(jié)前部之間的生殖節(jié)中表達，AbdB對生殖器官的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用且該功能非常保守[29]。凡納濱對蝦LvabdB基因從無節(jié)幼體時期開始連續(xù)上調(diào)表達，但是表達量都很低，與Lvubx/LvabdA呈現(xiàn)一種此消彼長的表達趨勢。推測，AbdB在凡納濱對蝦發(fā)育早期主要是與Lvubx和LvabdA共同參與調(diào)控體節(jié)和附肢形成，調(diào)控生殖器官發(fā)育的功能可能在仔蝦后期發(fā)揮作用。

本研究中發(fā)現(xiàn)Lvlab、lvmsx和lvubx擁有多個轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本開始表達的時期、表達量及表達上調(diào)下調(diào)的趨勢各不相同(見圖5)。不同的轉(zhuǎn)錄本作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可能調(diào)控不同的靶基因或?qū)ν话谢虻恼{(diào)控方式不同，從而引起不同的效應(yīng)，例如造成體節(jié)特異的特征等[18]。由于目前缺乏對蝦全基因組參考序列，目前還不能確定這些轉(zhuǎn)錄本是來自于可變剪切還是基因家族，隨著研究的深入和對蝦基因組序列數(shù)據(jù)的完善，這些轉(zhuǎn)錄本的來源和功能可以獲得更深入的闡釋。

圖5 凡納濱對蝦多轉(zhuǎn)錄本的Hox基因在不同發(fā)育時期的表達Fig.5 The expressions of Hox genes with more than one transcripts in difference early development stage of L. vannamei

2.5 凡納濱對蝦Hox基因的同源關(guān)系分析

現(xiàn)在普遍認為所有的Hox基因擁有共同的祖先，經(jīng)歷多次基因復(fù)制或基因組加倍事件后逐漸產(chǎn)生具有不同功能的Hox基因。將13條Hox基因的Homeodomain序列進行比對和聚類分析，發(fā)現(xiàn)在凡納濱對蝦中，按照節(jié)肢動物Hox基因排列順序相鄰的2個Hox基因首先聚為一類，其次再和相隔基因聚在一起，如Lvpb和Lvhox3聚類后再與Lvlab聚類，Lvubx和LvabdA聚類后與Lvftz和Lvantp聚類然后再與Lvscr聚類(見圖6)。這也在一定程度上支持了Hox基因擁有同一祖先的假設(shè)。聚類和同源性分析研究也發(fā)現(xiàn)存在于凡納濱對蝦中的3個Hox基因Lvmsx、Lvmnx和Lvdll與其他Hox基因的關(guān)系較遠，自成一支，這3個基因或許都屬于比較古老的Hox基因。

圖6 凡納濱對蝦Hox基因的同源關(guān)系Fig.6 The homology of Hox homoedomain sequence of L. vannamei

3 結(jié)語

作為生物發(fā)育過程中至關(guān)重要的一類基因，Hox基因在漫長的進化中，各自的序列和功能既保守又動態(tài)變化，它們彼此之間相互作用，在時空順序上組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同決定生物體的組織發(fā)育和形態(tài)特征等。在凡納濱對蝦中首次發(fā)現(xiàn)了13種Hox基因，序列結(jié)構(gòu)分析和同源比對結(jié)果顯示這些Hox基因的Homeobox序列和Homeodomain都很保守，不僅是同一類型Hox基因與遠緣物種-果蠅間保守，并且凡納濱對蝦的不同類型的Hox基因之間也具有一定的同源性，支持Hox來源域同一祖先的說法。通過對這些Hox基因在對蝦早期發(fā)育不同時期的表達模式的分析，認為這些Hox基因全部參與了凡納濱對蝦的早期發(fā)育，且按一定的時空順序先后開始表達。推測Lvlab、Lvmsx、Lvhox3、Lvdfd和Lvftz可能參與調(diào)控凡納濱對蝦觸角、大顎的發(fā)育，Lvhox3和Lvftz2個基因可能仍具有Hox基因的功能。Lvdll和Lvmnx可能與3對附肢的后期發(fā)育有關(guān)，并且與Lvpb、Lvscr、Lvantp共同參與口器和消化器官的發(fā)育形成。同時發(fā)現(xiàn)這些Hox基因之間可能存在相互抑制共同作用的情況，如Lvubx、LvabdA和LvabdB3個基因之間相互作用共同調(diào)節(jié)和完善凡納濱對蝦胸腹節(jié)及其附肢的發(fā)育。根據(jù)不同時期凡納濱對蝦的生長發(fā)育情況，推測了Hox基因在這些時期可能行使的功能，這些結(jié)果為今后的對蝦體節(jié)發(fā)育和Hox基因的功能驗證研究提供了參考,為深入研究甲殼動物的進化及解釋其形態(tài)多樣性提供了更多的信息。

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責(zé)任編輯 高 蓓

HoxGenes and Their Expression Pattern in Early Development ofLitopenaeusvannamei

SUN Xiao-Qing1,2， WEI Jian-Kai1,2, YUAN Jian-Bo1, ZHANG Xiao-Jun1, LI Fu-Hua1, XIANG Jian-Hai1

(1. The Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Hoxgenes involve in early embryonic development of animals and regulate the formation of body segments, tissues and organs. They have been widely studied to explain the morphological development and evolution in insects, especially inDrosophila, but rarely in crustaceans, which is the second largest group of arthropods. In this study, by RNA-seq sequencing and bioinformatics analysis, we found 13Hoxgenes in Pacific white shrimp (Litopenaeusvannamei):Lvlab,lvpb,lvhox3,lvdfd,lvscr,lvftz,lvmsx,lvdll,lvmnx,lvantp,lvubx,lvabdAandlvabdB. Molecular clone and sequence analysis showed the 13Hoxgenes are conserved in sequence structure. By analysis the expression pattern of these genes at the early development stages ofL.vannamei, we found that their expression indicated a dynamic change at different development stages and acoording a temporal order based on different function. Our findings suggested that there is a complicated interaction with theHoxgenes together to determine the morphology of the shrimp. This study provided important information for the morphological development and evolution analysis in crustaceans.

Hoxgene;Litopenaeusvannamei; crustacean; early development; expression pattern

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2012AA092205；2012AA10A404);國家自然科學(xué)基金項目(31172396；31272683)資助

2014-09-30；

2014-12-12

孫曉晴(1985-),女，碩士生。E-mail：xiaoqingsun@126.com

?? 通訊作者： E-mail： xjzhang@qdio.ac.cn

Q959.223

A

1672-5174(2015)08-052-11

10.16441/j.cnki.hdxb.20140323