李 燦，胡 芳，朱瑞娟，陳同強，鄧西貝，王淑敏，封士蘭,*

（1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111；3.長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林 長春 130117）

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長柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A的分離純化及降血糖活性

李 燦1,2，胡 芳1，朱瑞娟1，陳同強2，鄧西貝3，王淑敏3，封士蘭3,*

（1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111；3.長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林 長春 130117）

摘 要：研究長柄側(cè)耳胞外多糖分離純化方法及對糖尿病小鼠的降血糖作用。從長柄側(cè)耳液體發(fā)酵液中提取出長柄側(cè)耳胞外多糖，采用Sevag法除蛋白、H2O2脫色素、透析和Sepadex G-200、100柱色譜分離純化得到一種分子質(zhì)量單一的多糖組分PSEPS2-A，以凝膠滲透色譜與光散射儀聯(lián)用技術(shù)（gel permeation chromatography-eighteen angle laser scattering detector，GPC-MALLS）和元素分析等其他化學分析法考察多糖的理化性質(zhì)。以四氧嘧啶誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，通過不同劑量PSEPS2-A治療，比較治療前后小鼠體質(zhì)量及空腹血糖值、糖耐量水平、臟器指數(shù)、肝組織肝糖原水平變化。結(jié)果表明：PSEPS2-A的分子質(zhì)量為6.268×105D，在0.9% NaCl溶液中為棒狀結(jié)構(gòu)的多糖。PSEPS2-A能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖值（P＜0.05）和血糖曲線下面積（P＜0.05），減緩糖尿病小鼠體質(zhì)量的負增長；顯著降低肝臟、腎臟臟器指數(shù)（P＜0.05），顯著升高肝糖原水平（P＜0.05），促進肝糖原合成。PSEPS2-A是一種新的長柄側(cè)耳胞外多糖，在一定劑量下具有調(diào)節(jié)糖代謝、降低血糖、改善糖尿病癥狀的作用。

關(guān)鍵詞：長柄側(cè)耳；胞外多糖；分離純化；糖尿??；降血糖

E-mail：lic2012@lzu.edu.cn

長柄側(cè)耳（Pleurtus spodotecus Fr.）系傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬食藥用真菌，別名灰白側(cè)耳，主要分布在吉林、云南等地。長柄側(cè)耳不僅營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)肥厚、味道鮮美，而且含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、核苷酸和不飽和脂肪酸，具有很高的醫(yī)療保健作用，有延年益壽的功效[1-3]。作為自然界中含量最豐富的大分子聚合物之一，多糖廣泛分布于動植物、真菌和細菌中[4]，可通過其特異性識別受體[5]發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性潰瘍、抗氧化、防衰老等多種功效[6-8]。

目前，糖尿病的發(fā)病率日益增高，嚴重危害人類健康，糖尿病導(dǎo)致的死亡率已在繼心血管疾病和癌癥之后位列第三[9]。糖尿病是一種多病因的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，尚無理想的治療方法。傳統(tǒng)磺酰脲類和雙胍類降糖藥，久用會產(chǎn)生依賴性和不良反應(yīng)。近年來，國內(nèi)外學者開始從天然產(chǎn)物中篩選降糖類化合物[10-12]，取得了一些進展。目前研究證實，真菌多糖有顯著的降低血糖、改善糖耐量、增加體內(nèi)肝糖原的作用[13-17]，其作用是由調(diào)節(jié)糖代謝、促進肝糖原的合成、減少肝糖原分解引起的。但是，目前對于長柄側(cè)耳的研究還停留在長柄側(cè)耳液體發(fā)酵技術(shù)研究等初步研究[18-19]，還未見長柄側(cè)耳胞外多糖分離純化和降血糖活性的相關(guān)報道。

本實驗從長柄側(cè)耳液體發(fā)酵液胞外多糖，經(jīng)分級醇沉、Sevag法除蛋白、H2O2脫色素和葡聚糖Sepadex柱色譜等步驟分離純化出一種均一組分PSEPS2-A，并對其純度和糖含量進行分析，考察不同劑量的PSEPS2-A降血糖作用，并對糖尿病小鼠血糖值、糖耐量和肝糖原水平等糖代謝相關(guān)指標進行測定，為研制降血糖功能性食品或藥物的開發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

清潔級昆明種小白鼠，體質(zhì)量（20±2）g，蘭州大學動物中心提供。

長柄側(cè)耳由長春中醫(yī)藥大學藥學院培養(yǎng)提供。

Sepadex G-200、Sepadex G-100 北京 Biotopped公司；葡萄糖標準單糖 中國食品藥品檢定研究院；剛果紅、牛血清白蛋白、四氧嘧啶（alloxan） 美國Sigma公司；消渴丸（批號：R01322） 廣州白云山中一藥業(yè)有限公司；口服葡萄糖（批號：121228） 重慶和平制藥有限公司；95%乙醇、生理鹽水 甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司；實驗中所用其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

BP211D型和BS224S型電子天平、Multi EA 4000元素分析儀 德國Elementar Analysensysteme公司；UV-1700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；紫外掃描儀（Lambda 25 Uv/Vis spectrometer） 美國Perkin Elmer公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；BS-100N自動部分收集器、BT-100N數(shù)顯恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；CR22GⅡ離心機 日本日立公司；Freezone 6PWS型真空冷凍干燥儀 美國Labconco公司；透析袋（截留相對分子質(zhì)量3 500） 美國科技發(fā)展公司；Waters 600高效液相色譜儀、UltrahydrogelTM1000、500色譜柱、示差折光檢測器美國Waters公司；Dawn HeleosⅡ型十八角度激光散射儀美國懷雅特技術(shù)公司；三諾安穩(wěn)血糖測試儀 長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司；Well scan MK3型酶標儀芬蘭Thermo Labsystems公司。

1.3方法

1.3.1多糖的提取與分離純化[20-23]

長柄側(cè)耳發(fā)酵液參照齊放等[22]的方法經(jīng)液體發(fā)酵制得；最終得長柄側(cè)耳發(fā)酵液共40 L，雙層紗布過濾，10 000×g離心10 min，得到上清液，60 ℃濃縮至5 L。加入95%的乙醇至乙醇終體積分數(shù)達到30%，在4 ℃條件下靜置過夜，離心，去除沉淀，上清液繼續(xù)加入95%乙醇至乙醇終體積分數(shù)達到50%，在4 ℃條件下靜置過夜，離心，收集沉淀，冷凍干燥得長柄側(cè)耳胞外多糖2 （PSEPS2），PSEPS2經(jīng)Sevag法脫蛋白和H2O2除色素后再次以95%乙醇醇沉至50%，以透析袋流水透析48 h、雙蒸水透析24 h，冷凍干燥。用水溶解后（控制質(zhì)量濃度在30 mg/mL左右），經(jīng)Sepadex G-200柱（2.6 cm×70 cm）分離，雙蒸水0.5 mL/min洗脫，每管12 min，收集20 h，苯酚-硫酸法測定糖含量，收集主要餾分，后經(jīng)Sepadex G-100柱（2.6 cm×67 cm）分離，雙蒸水0.5 mL/min洗脫，收集20 h得到PSEPS2-A分子質(zhì)量單一的組分。

1.3.2 多糖的理化性質(zhì)測定

對PSEPS2-A進行外觀及溶解性、碘-碘化鉀反應(yīng)、Molish試劑反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)等[24]分析，多糖中碳（C）、氫（H）、氮（N）、硫（S）采用元素分析儀進行分析。

PSEPS2-A總糖質(zhì)量分數(shù)的測定用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準單糖；蛋白質(zhì)含量測定用Bradford法[23]，以牛血清白蛋白為標準蛋白，全波長紫外掃描檢測多糖是否含有核酸和蛋白質(zhì)。采用高效凝膠色譜（high performance liquid chromatography-gel permeation chromatography，HPLC-GPC）示差折光檢測器聯(lián)用方法對PSEPS2-A進行均一性鑒定，色譜柱為凝膠滲透色譜柱UltrahydrogelTM1000、500串聯(lián)，體積流量0.8 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測器溫度為35 ℃，流動相為蒸餾水。

1.3.3 分子質(zhì)量、分子構(gòu)象及分子質(zhì)量分布[23]

采用凝膠滲透色譜與光散射儀聯(lián)用技術(shù)（GPC-eighteen angle laser scattering detector，GPC-MALLS）測定其分子質(zhì)量、分子構(gòu)象及相對分子質(zhì)量分布，流動相為質(zhì)量分數(shù)0.9% NaCl與質(zhì)量分數(shù)0.02% NaN3的混合溶液。色譜柱為凝膠滲透色譜柱UltrahydrogelTM1000、500 串聯(lián)，體積流量0.8 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測器溫度為35 ℃。

1.3.4 剛果紅反應(yīng)

剛果紅可與具有三螺旋構(gòu)象的多糖形成復(fù)合物，復(fù)合物的λmax與剛果紅相比發(fā)生紅移，因此根據(jù)所研究多糖的水溶液與剛果紅形成配合物的λmax的變化情況，可判斷出所研究多糖是否具有螺旋結(jié)構(gòu)[24]。取5 mg PSEPS2-A樣品，加入2 mL蒸餾水和2 mL 80 μmol/mL剛果紅溶液，逐漸加入4.0 mol/L NaOH，使溶液中的NaOH終濃度分別為0.00、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00 mol/L?；靹?，室溫放置30 min 后，用紫外-可見分光光度計于200～700 nm波長范圍內(nèi)掃描各溶液的最大吸收波長。另外按照上述方法配制不同NaOH濃度的剛果紅溶液，作為對照。以NaOH溶液濃度為橫坐標，λmax為縱坐標作圖。

1.3.5 糖尿病小鼠模型構(gòu)建及實驗設(shè)計

取健康昆明種雄性小鼠80 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，禁食（不禁水）12 h，尾靜脈注射四氧嘧啶80 mg/kg，間隔24 h后腹腔注射四氧嘧啶80 mg/kg。為了避免藥物在成模前引起的動物低血糖相及其可能對小鼠造成的應(yīng)激性損害，每次注射給藥后2.5～5 h，灌胃質(zhì)量分數(shù)為50%葡萄糖，0.5 mL/只。末次給藥72 h后，禁食（不禁水）10 h，斷尾取血，測空腹血糖值（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）。FBG＞11.1 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿者，判定為建模成功。

將建模成功的60 只小鼠隨機分為糖尿病模型組、陽性對照組（消渴丸）、PSEPS2-A低劑量組、PSEPS2-A中劑量組、PSEPS2-A高劑量組，每組12 只，編號。另隨機抽取12只沒有注射四氧嘧啶的小鼠作為空白對照組。陽性對照組（消渴丸1 g/kg）、PSEPS2-A低劑量組（0.086 4 mg/kg）、PSEPS2-A中劑量組（0.172 8 mg/kg）、PSEPS2-A高劑量組（0.259 2 mg/kg）[25]按體質(zhì)量灌胃給藥，糖尿病模型組和空白對照組灌胃給予生理鹽水0.1 mL/10 g。每天灌胃給藥1次，連續(xù)15 d。

1.3.6 指標檢測

觀察小鼠飲食、飲水、尿量、體質(zhì)量（分別在小鼠造模前、造模成功后、給藥第5、10、15天稱量小鼠的體質(zhì)量）、精神狀態(tài)、毛色等狀況。

血糖測定：用血糖儀測定第5、10、15天禁食3 h、灌胃5 h后的血糖值；糖耐量[26]測定：在第15天斷尾采血后給藥1 次，并在給藥后0.5 h給予葡萄糖2.0 g/kg灌胃，于灌胃葡萄糖后0.5、2 h斷尾采血測血糖值（0 h的血糖值采用第15天給葡萄糖前的空腹血糖值），計算血糖曲線下面積，比較各組動物血糖值及灌胃葡萄糖后各時間點血糖曲線下面積的變化。

臟器指數(shù)測定：脫臼處死小鼠，取肝臟、腎臟、胸腺和脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織，稱質(zhì)量，并以其質(zhì)量（g）和動物體質(zhì)量（g）的比值表示小鼠的臟器指數(shù)。

肝糖原含量測定（蒽酮法）[27]：取小鼠肝臟400 mg，加質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸制備組織勻漿，取10%三氯乙酸肝勻漿液l mL，置于10 mL刻度試管中，加入10 mol/L KOH 1 mL，置沸水浴煮沸1 h。取出冷卻后，加入0.5 mL冰醋酸中和過量的堿，加水至10 mL。同時用10 mL容量瓶配制不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標準液（倍比稀釋），以吸光度為縱坐標，以葡萄糖標準液質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y=1.052 6x＋0.030 3（R2=0.996 9）。取上述樣品溶液和標準溶液各l mL置于試管中，移入冰水浴內(nèi)，分別加入蒽酮試劑4 mL，搖勻，待冷至室溫后，移至沸水浴中，6 min后取出，放入冰水浴中冷卻。在分光光度計650 nm波長處用空白管調(diào)零，比色測定吸光度。將測得的吸光度代入標準曲線，得小鼠肝糖原含量。

2　結(jié)果與分析

2.1多糖的分離與純化結(jié)果

圖 1 多糖PSEPS2-A經(jīng)Sephadex G-200（A）和Sephadex G-100（B）柱層析色譜圖Fig.1 Sephadex G-200 (A) and Sephadex G-100 (B) column chromatography of PSEPS2-A

長柄側(cè)耳發(fā)酵液40 L，經(jīng)過濾、離心、濃縮至5 L后醇沉得長柄側(cè)耳胞外多糖2（PSEPS2）粗多糖60.71 g，又經(jīng)除蛋白、脫色素、透析、SephadexG-200 和SephadexG-100排阻色譜分離純化得白色絮狀長柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A 5.52 g，得率為0.138 g/L。SephadexG-200和SephadexG-100柱層析色譜洗脫曲線如圖1所示，PSEPS2-A經(jīng)過SephadexG-200時峰型并未完全分離開，故收集主峰洗脫液濃縮、真空冷凍干燥后繼續(xù)上SephadexG-100，得到峰型單一主峰，表明PSEPS2-A純化完全，濃縮主峰洗脫液，冷凍干燥得純化好的PSEPS2-A。

2.2多糖理化性質(zhì)

PSEPS2-A外觀為白色絮狀，無味，易溶于水，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑；碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，說明所得產(chǎn)品中不含淀粉；茚三酮反應(yīng)呈陰性，說明所得產(chǎn)品中不含有蛋白質(zhì)；Molish 反應(yīng)呈陽性，說明所得產(chǎn)品中含有糖類物質(zhì)。PSEPS2-A的總糖質(zhì)量分數(shù)為97.51%，未檢出蛋白質(zhì)。由圖2可知，全波長掃描在260、280 nm波長處沒有吸收峰，說明不含核酸和蛋白質(zhì)。元素分析結(jié)果顯示C、H、S、N 的質(zhì)量分數(shù)分別為39.37%、6.40%、1.90%、0.00%，經(jīng)計算得O元素的質(zhì)量分數(shù)為52.33%，C、H、O 的物質(zhì)的量比約為1∶2∶1，符合多糖的元素及組成比例，N元素含量為0證明PSEPS2-A不含蛋白質(zhì)。由圖3可知， PSEPS2-A經(jīng)過HPLC-GPC檢測，呈單一對稱峰，根據(jù)峰面積歸一化法計算質(zhì)量分數(shù)為96.7%，說明該組分是分子質(zhì)量單一的多糖。

圖2　PSEPS2-A全波長掃描圖譜Fig.2 Full wavelength scan of PSEPS2-A

圖3　PSEPS2-A的高效液相凝膠色譜圖Fig.3 HPLC-GPC of PSEPS2-A

2.3多糖分子質(zhì)量、分子構(gòu)象及分子質(zhì)量分布分析

采用示差折光檢測器和激光檢測器分別記錄供試品質(zhì)量濃度和供試品在不同角度的光散射強度；比折光指數(shù)增量值（dn/dc）為0.138，通過多角度激光散射儀自帶ASTRAV軟件計算得到PSEPS2-A的分子質(zhì)量為6.268×105D、分布指數(shù)d＝Mw/Mn＝1.014（Mw為重均分子質(zhì)量，Mn為數(shù)均分子質(zhì)量）。分布指數(shù)接近1.00說明PSEPS2-A分布呈單分散性，即表明摩爾質(zhì)量分布范圍較集中，分子大小均一；以旋轉(zhuǎn)均方根半徑對摩爾質(zhì)量作圖（圖4）得到的斜率為1.03，說明PSEPS2-A的構(gòu)象為棒狀。

圖4　多糖PSEPS2-A均方根旋轉(zhuǎn)半徑對摩爾質(zhì)量圖Fig.4 Root mean square turning radius of PSEPS2-A

圖5　不同堿濃度下剛果紅與多糖混合液的波長變化Fig.5 Absorption wavelength change of Congored-polysaccharide complex in different concentrations of NaOH solutions

2.4剛果紅反應(yīng)分析

由圖5可知，多糖與剛果紅作用后在低濃度的NaOH溶液中發(fā)生紅移，說明PSEPS2-A存在三螺旋結(jié)構(gòu)；在高濃度NaOH溶液中沒有此現(xiàn)象，說明多糖結(jié)構(gòu)由于堿濃度的增加將有序結(jié)構(gòu)破壞至無序結(jié)構(gòu)，因為棒狀結(jié)構(gòu)能影響線性分子間氫鍵的穩(wěn)定性。

2.5小鼠基本生活狀況觀察

造模后小鼠多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕，即“三多一少”癥狀十分明顯，PSEPS2-A 3個劑量組和陽性對照組小鼠隨實驗進程癥狀逐漸緩解、反應(yīng)靈活、毛發(fā)平伏有光澤。實驗中，有個別組中有老鼠意外死亡的情況，可能原因是個體差異和人為操作因素。

2.6PSEPS2-A對糖尿病小鼠空腹血糖值的影響

由表1可知，實驗期間，造模后小鼠空腹血糖值顯著升高，與空白對照組比較差異極顯著（P＜0.01），顯示造模成功。開始給藥后，PSEPS2-A高、中、低劑量組小鼠血糖值逐漸降低，在給藥15 d后明顯低于給藥前水平（P＜0.01）；在給藥15 d后，PSEPS2-A高、中、低劑量組、陽性對照組與糖尿病模型組比較差異極顯著（P＜0.01）；在給藥15 d后，PSEPS2-A高、中、低劑量組與陽性對照組比較差異不顯著。表明PSEPS2-A具有明顯控制糖尿病小鼠空腹血糖值升高、降低其血糖值的作用，且有與消渴丸相當?shù)淖饔?，并存在一定的劑量依賴關(guān)系。

表1　多糖PSEPS2-A對糖尿病小鼠空腹血糖值的影響（±s）Table 1 Effect of PSEPS2-A on blood glucose in alloxan-induced diabetic miccee (±s)

表1　多糖PSEPS2-A對糖尿病小鼠空腹血糖值的影響（±s）Table 1 Effect of PSEPS2-A on blood glucose in alloxan-induced diabetic miccee (±s)

注：—. 不給藥；*. 與空白對照組比較差異極顯著（P＜0.01）；**. 與糖尿病模型組比較差異極顯著（P＜0.01）；▲.與給藥前比較差異顯著（P＜0.05）；▲▲.與給藥前比較差異極顯著（P＜0.01）。

組別　劑量/動物　血糖值/（mmol/L）（g/kg）　只數(shù)　給藥前　給藥5 d　給藥10 d　給藥15 d空白對照組　—　12　4.74±0.89　3.97±0.78　4.44±0.84　4.95±0.95糖尿病模型組　—　12　18.08±3.79* 18.87±2.99* 17.07±5.96*　17.85±4.22* PSEPS2-A低劑量組　0.086 4　12　17.66±3.08* 12.89±2.87　9.71±3.13　8.69±1.67**▲PSEPS2-A中劑量組　0.172 8　10　18.13±2.15* 12.20±2.11　8.72±3.00　7.63±1.89**▲PSEPS2-A高劑量組　0.259 2　11　17.74±1.72*　10.1±1.84　8.15±1.97　7.11±1.61**▲▲陽性對照組　1.000 0　11　17.25±2.67* 13.97±3.59 10.22±2.679 8.85±3.59**▲

2.

表2　多糖PSEPS2-A對糖尿病小鼠糖耐量的影響（±s）Table 2 Effect of PSEPS2-A on glucose tolerance in alloxan-induced diabetic mice±s)

表2　多糖PSEPS2-A對糖尿病小鼠糖耐量的影響（±s）Table 2 Effect of PSEPS2-A on glucose tolerance in alloxan-induced diabetic mice±s)

注：*. 與空白對照組比較差異極顯著（P＜0.01）；**. 與糖尿病模型組比較差異極顯著（P＜0.01）；▲.與陽性對照組比較差不異顯著（P＞0.05）。

組別　劑量/血糖值/（mmol/L）　曲線下面積/（g/kg）0 h　0.5 h　2 h（mmol/L）空白對照組　—　4.95±0.95　12.37±1.26　5.12±0.92　17.45±2.28糖尿病模型組　—　17.85±1.22　28.63±2.23　19.14±2.06　47.45±4.06* PSEPS2-A低劑量組　0.086 4　8.69±1.67　16.24±1.86　8.41±2.01　24.72±1.87**▲PSEPS2-A中劑量組　0.172 8　7.63±1.89　14.52±2.07　7.67±1.94　22.18±1.98**▲PSEPS2-A高劑量組　0.259 2　7.11±1.61**　13.69±1.55**　7.02±1.45** 20.73±2.04**▲陽性對照組　1.000 0　8.85±3.59　16.13±1.28　7.56±1.17　23.76±3.25

由表2可知，糖尿病模型組小鼠血糖曲線下面積與空白對照組比較極顯著升高（P＜0.01），PSEPS2-A 各劑量組血糖曲線下面積的降低與糖尿病模型組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且有明顯的量效關(guān)系，與陽性對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。表明PSEPS2-A具有明顯降低糖尿病小鼠血糖曲線下面積的作用，且有與消渴丸相當?shù)淖饔茫⒋嬖谝欢ǖ膭┝恳蕾囮P(guān)系。

2.8PSEPS2-A對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

由圖6可知，小鼠在造模后體質(zhì)量與空白對照組相比均顯著降低（P＜0.05）；實驗期間，PSEPS2-A 3個劑量組和陽性對照組小鼠體質(zhì)量與糖尿病模型組相比均顯著回升（P＜0.05）。PSEPS2-A 3個劑量組中，隨著劑量的增加，小鼠體質(zhì)量增長明顯，各劑量組在給藥后10 d起均高于造模前水平，并以PSEPS2-A高劑量組體質(zhì)量增長最明顯。表明PSEPS2-A具有一定促進糖尿病小鼠體質(zhì)量恢復(fù)的作用，并存在一定的劑量依賴關(guān)系。

圖6　多糖PSEPS2-A對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of PSEPS2-A on body weight in alloxan-induced diabetic mice

2.9PSEPS2-A對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

圖7　多糖PSEPS2-A對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.7 Effect of PSEPS2-A on organ indexes in alloxan-induced diabetic mice

由圖7可知，糖尿病模型組小鼠肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與空白對照組比較均顯著升高，PSEPS2-A高劑量組與糖尿病模型組對比差異顯著（P＜0.05），與空白對照組對比則無顯著性差異（P＞0.05）。各組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均無顯著性差異。表明糖尿病小鼠肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均升高，而PSEPS2-A 具有降低臟器指數(shù)恢復(fù)到正常水平趨勢的作用，但對小鼠免疫器官的作用不是很明顯。

2.10PSEPS2-A對糖尿病小鼠肝糖原水平的影響

由圖8可知，糖尿病模型組小鼠肝糖原含量明顯低于空白對照組（P＜0.05）；PSEPS2-A 3個劑量組和陽性對照組小鼠肝糖原水平均顯著高于糖尿病模型組（P＜0.05）；與陽性對照組相比，PSEPS2-A中、低劑量組小鼠肝糖原水平略高于陽性對照組，高劑量組差異顯著（P＜0.05），說明PSEPS2-A促進糖尿病小鼠肝糖原合成作用優(yōu)于消渴丸，且存在劑量依賴關(guān)系。

圖8　多糖PSEPS2-A對糖尿病小鼠肝糖原水平的影響Fig.8 Effect of PSEPS2-A on hepatic glycogen level in alloxan-induced diabetic mice

3　結(jié) 論

長柄側(cè)耳等側(cè)耳屬真菌含有多種氨基酸、維生素、礦物元素等，具有較好的食用和藥用價值，是一種極具開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的食藥用菌，但目前對于長柄側(cè)耳胞外多糖的分離純化以及生物學活性的研究較少，本實驗利用從長柄側(cè)耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基中制備的胞外粗多糖，經(jīng)過除蛋白、脫色素和Sepadex凝膠柱色譜等一系列分離純化得到一種均一化多糖PSEPS2-A。

糖尿病性高血糖癥主要體現(xiàn)在葡萄糖在血液中的濃度過高帶來的血糖升高[28]。一些證據(jù)表明，胰島β細胞的主要功能是參與胰島素的產(chǎn)生和釋放，β細胞通過內(nèi)源性胰島素的調(diào)節(jié)，降低血糖濃度，從而抑制糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥[29]。四氧嘧啶是一種β細胞毒劑，可選擇性地損傷多種動物的胰島β細胞，造成胰島素分泌的下降，引起實驗性糖尿病[30]。本研究以四氧嘧啶制備糖尿病小鼠模型，以消渴丸作為陽性藥參照，研究長柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A對實驗性糖尿病小鼠血糖的影響。實驗結(jié)果表明，PSEPS2-A對四氧嘧啶所致胰島素依賴型糖尿病小鼠血糖升高有顯著的抑制作用，糖耐量實驗表明PSEPS2-A能顯著提高糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力，能較快地抑制餐后血糖的上升，這可能是由于PSEPS2-A可以減弱四氧嘧啶對胰島β細胞的損傷、增加胰島素的分泌，從而發(fā)揮降糖及改善糖耐量作用所致；給藥組小鼠體質(zhì)量回升明顯，肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均有一定程度的降低，說明PSEPS2-A可能對糖尿病導(dǎo)致的肝臟、腎臟腫大有較好的恢復(fù)能力；給藥組的肝糖原水平有明顯增高，表明PSEPS2-A能促進血糖進入肝臟，使肝糖原合成增加；以上各項指標存在一定的劑量依賴關(guān)系，而且PSEPS2-A的治療療效都要稍好于消渴丸的治療療效。

綜上分析，從長柄側(cè)耳液體發(fā)酵液中分離純化出來的長柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A具有調(diào)節(jié)糖代謝、降低血糖、改善糖尿病癥狀的作用，且作用機制是多方面綜合影響的，有繼續(xù)深入研究的價值。

參考文獻：

[1]李玉. 藥用菌物學[M]. 長春: 吉林科技出版杜, 1996: 61-62.

[2]汪麟, 李育岳. 20種食用菌的氨基酸含量分析[J]. 食品科學, 1995, 16(4): 10-12.

[3]戴玉成, 周麗偉, 楊祝良, 等. 中國食用菌名錄[J]. 菌物學報, 2010, 29(1): 1-21.

[4]戴慧, 高曉明. 多糖特異性免疫識別的分子機制及其免疫生物學意義[J]. 中國免疫學雜志, 2009, 25(1): 35-39.

[5]ESTEBAN A, POPP M W, VK V, et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2011, 108(34): 14270-14275.

[6]蘭中芬, 張兆林, 程周權(quán), 等. 紅芪多糖成分的分析及其小鼠免疫功能與移植性腫瘤的作用[J]. 中國藥理學報, 1987, 8(3): 275-277.

[7]SONG Qinghua, KOBAYASHI T, XIU Limei, et al. Effects of Astragali root and Hedysari root on the murine B and T cell differentiation[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2000, 73(1/2): 111-119.

[8]權(quán)菊香, 杜貴友. 黃芪與紅芪對腦缺血動物保護作用的研究[J]. 中國中藥雜志, 1998, 23(6): 51-53.

[9]劉穎, 金宏, 許志勤, 等. 南瓜多糖對糖尿病大鼠血糖和血脂的影響[J].中國應(yīng)用生理學雜志, 2006(3): 358-361.

[10]金智生, 李應(yīng)東, 汝亞琴, 等. 紅芪多糖對糖尿病大鼠腎組織勻漿NO、NOS及過氧化脂質(zhì)的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志, 2004, 11(3): 141-144.

[11]WANG Junzhi, ITO H, SHIMURA K, et al. Enhancing effect of antitumor polysaccharide from Astragalus or Radix hedysarum on C3 cleavage production of macrophages in mice[J]. Japanese Journal of Pharmacology, 1989, 51(3): 432-434.

[12]肖遐, 吳雄, 何純蓮. 百合多糖對Ⅰ型糖尿病大鼠降血糖作用[J]. 食品科學, 2014, 35(1): 209-231. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201401041.

[13]陶美華, 章衛(wèi)民, 潘清靈, 等. 幾種藥用真菌粗多糖降血糖作用研究[J].食用菌學報, 2009, 16(1): 59-62.

[14]ASLAN M, ORHAN N, ORHAN D D, et al. Hypoglycemic activity and antioxidant potential of some medicinal plants traditionally used in Turkey for diabetes[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 128(2): 384-389.

[15]CHEN Xiaoming, JIN Jing, TANG Jia, et al. Extraction, purification, characterization and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the root of Ophiopogon japonicus[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83(2): 749-754.

[16]R A M A C H A N D R A N S , R A J A S E K A R A N A , MANISENTHILKUMAR K T. Investigation of hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of aqueous extract of Terminalia paniculata bark in diabetic rats[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2012, 2(4): 262-268.

[17]毛勇. 深層發(fā)酵雙孢菇胞外多糖的研究[D]. 無錫: 江南大學, 2013: 63-66.

[18]謝兆莉. 參菇多糖的開發(fā)研究[D]. 長春: 長春中醫(yī)藥大學, 2012: 34-36.

[19]齊放, 宋啟印, 王淑敏. HPLC法測定長柄側(cè)耳中的洛伐他汀含量[J].中國食用菌, 2009, 28(6): 39-40.

[20]DANG Zilong, FENG Demei, FENG Shilan, et al. Structure and antioxidant activity study of sulfated acetamido-polysaccharide from Radix Hedysari[J]. Fitoterapia, 2013, 89: 20-32.

[21]黨子龍, 劉小花, 封士蘭, 等. 紅芪多糖HPS4-1A的化學結(jié)構(gòu)特征研究及分子構(gòu)象初步分析[J]. 中草藥, 2013, 44(2): 141-146.

[22]齊放. 長柄側(cè)耳的菌種選育、發(fā)酵工藝及化學成分的研究[D]. 長春: 長春中醫(yī)藥大學, 2010: 33-35.

[23]楊濤, 郭龍, 李燦, 等. 紅芪多糖HPS1-D的化學結(jié)構(gòu)和抗補體活性研究[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(1): 7-11.

[24]張秀麗, 楊小明, 何娟, 等. 無花果多糖的部分理化性質(zhì)研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(11): 35-38.

[25]趙良功, 李曉東, 趙建輝, 等. 4種紅旗多糖對實驗性糖尿病血糖的影響[J]. 中藥材, 2009, 32(10): 1590-1592.

[26]陳建國, 步文磊, 王茵, 等. 桑葉多糖降血糖作用及其機制研究[J].中草藥, 2011, 42(3): 515-520.

[27]郭瑞華, 王慧麗, 翟義, 等. 四氧嘧啶型糖尿病模型小鼠糖耐量和肝糖原與大豆胰蛋白酶抑制劑的干預(yù)[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(24): 4470-4480.

[28]NATHAN D M, BUSE J B, DAVIDSON M B, et al. Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy: a consensus statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes[J]. Diabetes Care, 2009, 32(1): 193-203.

[29]DOMINGUEZ-BENDALA J, INVERARDI L, RICORDI C. Regeneration of pancreatic beta-cell mass for the treatment of diabetes[J]. Expert Opinion on Biological Therapy, 2012, 12(6): 731-741.

[30]黃進, 羅瓊, 李曉莉, 等. 大豆異黃酮的降血糖作用研究[J]. 食品科學, 2004, 25(1): 166-170.

Purification and Hypoglycemic Effect of Extracellular Polysaccharide from Pleurtus spodotecus Fr.

LI Can1,2, HU Fang1, ZHU Ruijuan1, CHEN Tongqiang2, DENG Xibei3, WANG Shumin3, FENG Shilan3,*
(1. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2. Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Changsha 410111, China; 3. School of Pharmaceutical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract:This study was conceived to investigate the isolation, purification and hypoglycemic effect of extracellular polysaccharides from Pleurtus spodotecus Fr. in diabetic mice. A homogeneous extracellular polysaccharide named as PSEPS2-A was extracted from the fermented broth of Pleurtus spodotecus Fr.. Then PSEPS2-A was treated with Sevag method, H2O2and purified with Sephadex gel filtration chromatography. GPC-MALLS and other methods were utilized to examine the physical and chemical properties of PSEPS2-A. The absolute molecular weight of PSEPS2-A was 6.268 × 105D and the structure was rod-like in 0.9% NaCl solution. Diabetic mice induced by Alloxan were subjected to continuous intragastric administration with different doses of PSEPS2-A. The changes in body weight, fasting blood glucose (FBG), glucose tolerance, organ index, and liver glycogen in diabetic mice were determined before and after the treatment. PSEPS2-A could significantly reduce the content of FBG (P < 0.05) and the area under curve of blood glucose (P < 0.05). The symptom of negative growth of body weights was slowed down and the organ index was decreased in diabetic mice. PSEPS2-A also could significantly promote liver glycogen synthesis and elevate the level of liver glycogen. PSEPS2-A is a new extracellular polysaccharide from Pleurtus spodotecus Fr., which plays an important role in regulating glucose metabolism, lowering blood sugar, and improving diabetic symptoms at a certain concentration.

Key words:Pleurtus spodotecus Fr.; extracellular polysaccharides; isolation and purification; diabetes; hypoglycemic

*通信作者：封士蘭（1957—），女，教授，博士，主要從事中藥小分子及大分子（多糖）化合物提取分離、結(jié)構(gòu)研究；中藥止咳、祛痰、降血鉛、降血糖等藥效研究。E-mail：fengshl@lzu.edu.cn

作者簡介：李燦（1989—），男，碩士研究生，主要從事中藥小分子及大分子（多糖）化合物提取分離、結(jié)構(gòu)研究。

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAI05B02）；吉林省科技廳自然科學基金項目（201205050）

收稿日期：2014-06-11

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507034

中圖分類號：TS201.3；Q946.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0183-06