張佰清，孫欄夢

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

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脈沖強光對啤酒酵母的誘變效應(yīng)

張佰清，孫欄夢

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

摘 要：采用脈沖強光對啤酒酵母菌種進行誘變處理，脈沖處理電壓分別為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 V，閃照次數(shù)分別為4、8、16、32、48。測定出發(fā)菌株和篩選出的變異菌株的凝聚性、雙乙酰產(chǎn)量、發(fā)酵速率、發(fā)酵結(jié)束理化性質(zhì)等指標，比較變異菌株與出發(fā)菌株綜合指標的差異。結(jié)果表明：經(jīng)過初篩和復(fù)篩，篩選出10#和12#兩株發(fā)酵性能較好的菌株。脈沖強光誘變處理并未對啤酒酵母的發(fā)酵度產(chǎn)生負面效應(yīng)，而是有所提高或保持原酵母菌株的優(yōu)良發(fā)酵性能。

關(guān)鍵詞：脈沖強光；啤酒酵母；誘變；變異菌株；出發(fā)菌株

脈沖強光誘變裝置是以交流電為電源，采用強光閃照的方法進行微生物誘變，它由一個動力單元和一個惰性氣體燈單元組成[1-4]。脈沖強光對微生物有多種影響，脈沖強光寬譜的光能產(chǎn)生全面的、不可逆的破壞作用，使得菌體細胞中的DNA、細胞膜、蛋白質(zhì)和其他大分子受到影響[5]。由于脈沖強光對微生物的核糖結(jié)構(gòu)有影響，就有可能對微生物發(fā)生誘導(dǎo)產(chǎn)生突變。

目前國內(nèi)外關(guān)于脈沖強光致死微生物的效果及機理研究較多。國內(nèi)研制出了自動控制脈沖強光殺菌裝置，對釀酒酵母、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌進行了不同照射時間的研究，得出影響脈沖強光殺菌效果的主要因素是閃照次數(shù)、菌液原始濃度及輸入電壓，其中閃照次數(shù)的影響最大[6-7]。國外，Macgregor等[8]研究了大腸桿菌Escherichia coli O157:H7和單核細胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes 4b在脈沖強光照射下的存活情況。Wekhof等[9-11]研究了脈沖強光對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis芽孢和黑曲霉菌Aspergillus niger孢子的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)不用UV-C波段脈沖強光也可以達到殺菌的效果。還有研究者發(fā)現(xiàn)脈沖強光能夠引起菌體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏并且使照射酵母的細胞結(jié)構(gòu)改變，脈沖強光和紫外光使菌體細胞受損傷的程度是不同的，脈沖強光照射對細胞膜的影響較大[12-16]。

本實驗利用脈沖強光技術(shù)對啤酒酵母進行誘變，比較啤酒酵母出發(fā)菌株和變異菌株之間基本發(fā)酵性能的差異，為脈沖強光技術(shù)在提高啤酒酵母發(fā)酵性能中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

啤酒酵母菌株，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物實驗室提供。

麥芽汁培養(yǎng)基：采用實驗室自制麥芽汁培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌處理，調(diào)糖度為8～10 °Bx，自然pH值。固體麥芽汁培養(yǎng)基：在麥芽汁培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)2%的瓊脂，0.1 MPa滅菌20 min；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）培養(yǎng)基：參照文獻[17]方法配制。

1.2儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；生物顯微鏡 上海光電公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；pHs-3C型酸度計 上海盛磁儀器有限公司；滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SZX-ZP超凈工作臺 上海博訊實業(yè)有限公司。

脈沖強光裝置由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院自行設(shè)計[18]，采用氙燈發(fā)出脈沖強光。光脈沖的脈沖寬度為20 μs，波長范圍為200～1 100 nm，最大輸出電壓為5 000 V，最大輸入能量為644 J。

1.3方法

1.3.1 啤酒酵母生長曲線的繪制

采用比濁法，即測定菌液在600 nm波長處的光密度（OD600 nm）值來確定菌種數(shù)，繪制啤酒酵母生長曲線。

1.3.2 菌懸液的制備

取實驗中心斜面保存的啤酒酵母菌1 環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以體積分數(shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接于另外的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)8 h，使細胞處于對數(shù)增殖中期，離心分離，將沉淀下來的菌體用生理鹽水洗滌兩次，懸浮于適量的生理鹽水中，制成細胞濃度為106個/mL的菌懸液。

1.3.3 脈沖強光處理與誘變處理條件的確定

在滅菌后的培養(yǎng)皿中加入10 mL實驗菌懸液，取下培養(yǎng)皿蓋，放入殺菌處理室內(nèi)，保證培養(yǎng)皿在氙燈的正下方。在脈沖強光閃照8 次、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察輸入電壓為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 V時對菌體致死率的影響；以及在輸入電壓1 500 V、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察脈沖強光閃照4、8、16、32、48 次時對菌體致死率的影響[19]。

1.3.4 菌株初篩

一般認為可遺傳穩(wěn)定變異最可能出現(xiàn)在致死率90%以上的區(qū)域內(nèi)[20]。由此，對脈沖強光處理后從第1代到第5代致死率都在90%以上的菌株，挑取菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和邊緣整齊的菌落12 株，接種至斜面固體YPD培養(yǎng)基上進行復(fù)篩。

1.3.5 菌株復(fù)篩

供復(fù)篩的菌株于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)24 h，再保藏于冷藏室內(nèi)，待用于耐受性實驗，并以此作為復(fù)篩的標準[21-23]。

1.3.6 分析測定方法

菌株凝聚性的測定采用光密度法[24]；雙乙酰產(chǎn)量的測定采用分光光度法[25]；酒精度的測定采用比重瓶法；發(fā)酵度的測定參照文獻[26]的方法進行；發(fā)酵速率的測定參照文獻[23]的方法進行。

2　結(jié)果與分析

2.1啤酒酵母出發(fā)菌株的生長曲線

圖1　啤酒酵母出發(fā)菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of S. cerevisiae

由圖1可知，啤酒酵母菌株的遲滯期為6 h（0～6 h），對數(shù)生長期為12 h（6～18 h），隨后開始進入穩(wěn)定期。因此在研究脈沖強光對啤酒酵母生理特性的影響和啤酒酵母對脈沖強光的抗性時，選擇在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至10～17 h的菌體進行實驗。在研究脈沖強光對啤酒酵母的致死機理時，選擇同步培養(yǎng)至18 h的菌體進行實驗。

2.2脈沖強光處理菌株的致死率曲線

在脈沖強光閃照8 次、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察輸入電壓為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 V時對菌體致死率的影響。

圖2　不同電壓條件下的菌體致死率Fig.2 Mortality of S. cerevisiae at different voltages

如圖2所示，隨著輸入電壓的增加，對菌體的致死率快速上升。在輸入電壓增加至1 500 V后對菌體的致死率上升速率開始減緩。在輸入電壓為1 500 V時，對菌體的致死率達到了87%；當輸入電壓為2 500 V時，對菌體的致死率達到了98%以上。

在輸入電壓1 500 V、菌液厚度3.4 mm、菌液透光率100%、菌液濃度一定的條件下，分別考察脈沖強光閃照4、8、16、32、48 次時對菌體致死率的影響。

如圖3所示，隨著閃照次數(shù)增加，對菌體的致死率逐漸增加。在閃照次數(shù)為8時，對菌體的致死率達到了89%；當閃照次數(shù)為32時，對菌體的致死率為99.8%，菌體幾乎全部死亡。

為研究脈沖強光對啤酒酵母菌是否具有誘變作用，根據(jù)以上結(jié)果來確定抗性篩選的脈沖處理條件，篩選具有一定耐受性的菌株。

圖3　不同閃照次數(shù)條件下的菌體致死率Fig.3 Mortality of S. cerevisiae with different pulsed light cycles

2.3初篩結(jié)果

表1　啤酒酵母菌對脈沖強光的抗性Table 1 Mortality of S. cerevisiae treated by pulsed lightt

由表1可知，選擇不同強度脈沖強光對啤酒酵母菌作用后，選取存活的啤酒酵母菌種進行斜面試管接種，重復(fù)刺激5 代后，脈沖條件為2 000 V/16 次和2 500 V/32 次的啤酒酵母菌的致死率有所下降。當處理強度達到3 000 V/48 次時，第5 代啤酒酵母的致死率為99.80%，此時第1～5代的致死率均達到95%以上。說明隨這處理強度的提高，致死作用加強，因此菌株在低處理強度時表現(xiàn)出抗性，而在高處理強度時表現(xiàn)為大量死亡。對脈沖條件為2 000 V/16 次和2 500 V/32 次下第5代存活的啤酒酵母菌種進行篩選得到12 株菌株（編號為1#～12#），并接種到斜面試管中保存，用于研究其耐滲性和發(fā)酵性能是否發(fā)生變化。

2.4復(fù)篩結(jié)果

2.4.1 不同殺滅溫度對菌株生長的影響

表2　不同殺滅溫度對菌株生長的影響Table 2 Effect of temperature on the growth of original and variant S. cerevisiae strains

由表2可知，出發(fā)菌株、1#、2#和3#菌株的殺滅溫度為54 ℃，4#、5#、6#、8#和9#菌株的殺滅溫度為56 ℃，而7#、10#、11#和12#菌株在56 ℃時仍然可以存活，因此選擇7#、10#、11#和12#菌株進行下一步實驗。

2.4.2 菌株耐糖性與耐酒精性

對7#、10#、11#和12#菌株進行耐糖性與耐酒精性實驗，結(jié)果見表3、4。

表3　不同葡萄糖質(zhì)量分數(shù)下各菌株產(chǎn)氣結(jié)果Table 3 Gas production by original and variantS. cerevisiae strains at different glucose concentrations

每隔24 h觀察試管產(chǎn)氣情況，結(jié)果見表3。在葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為50%的條件下培養(yǎng)72 h后，所有菌株均產(chǎn)氣；而在葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為60%的條件下培養(yǎng)72 h后，只有10#和12#菌株產(chǎn)氣，而出發(fā)菌株不能耐受此條件下的滲透壓。

表4　不同酒精度條件下各菌株產(chǎn)氣情況Table 4 Gas production by original and variantS. cerevisiae strains at different alcohol concentrations

由表4可知，出發(fā)菌株在酒精度為10%時就已經(jīng)不產(chǎn)氣，10#和12#菌株在酒精度為16%時依然產(chǎn)氣。與出發(fā)菌株相比，10#和12#菌株的耐酒精性更強。

由以上結(jié)果可知，脈沖強光可以篩選出具有高耐糖性與耐酒精性的變異菌株10#和12#，用這兩株菌株進行后續(xù)實驗。

2.5出發(fā)菌株和變異菌株凝聚性比較結(jié)果

圖4　出發(fā)菌株和變異菌株凝聚性的比較Fig.4 Comparison of flocculation ability between variant and original strains

由圖4可知，10#菌株的凝聚性較強，也相對適中，對照菌株和12#菌株的凝聚性相差不多。這說明10#菌株在發(fā)酵結(jié)束時沉淀速率較快，發(fā)酵液澄清速率也快。對照菌株和12#菌株發(fā)酵結(jié)束時沉淀速率慢，發(fā)酵液也不易澄清。

2.6出發(fā)菌株和變異菌株雙乙酰產(chǎn)量比較

雙乙酰是由丙酮酸形成的，雙乙酰及其相關(guān)產(chǎn)物都是酵母酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量甚微，但對酒的風味形成有很大的影響，是評價啤酒成熟與否的主要依據(jù)，其含量多少直接影響啤酒的品質(zhì)。當啤酒中雙乙酰含量超過風味閾值時，會有一種不愉快的飯餿味。

圖5　出發(fā)菌株和變異菌株雙乙酰產(chǎn)量在發(fā)酵過程中的變化Fig.5 Change in diacetyl concentration during yeast fermentation

由圖5可知，對照菌株的雙乙酰產(chǎn)量在發(fā)酵第1天出現(xiàn)峰值，達到0.364 mg/L，10#、12#菌株的雙乙酰產(chǎn)量均在發(fā)酵第3天出現(xiàn)峰值，達到0.328、0.359 mg/L，對照菌株比10#菌株和12#菌株早2 d出現(xiàn)峰值，并且含量稍高，發(fā)酵完畢后，雙乙酰產(chǎn)量分別為對照菌株0.176 mg/L、10#菌株0.136 mg/L、12#菌株0.171 mg/L。實驗結(jié)果表明，10#菌株的雙乙酰還原能力較對照菌株和12#菌株更加優(yōu)良。

2.7啤酒酵母的發(fā)酵速率

將出發(fā)菌株和變異菌株以1.8×107個/mL進行接種，在25 ℃條件下培養(yǎng)，測定其發(fā)酵速率，結(jié)果見圖6。

圖6　對照菌株與變異菌株發(fā)酵速率的比較Fig.6 Comparison of fermentation rate between variant and original strains

由圖6可知，10#菌株的降糖速率最快，在第5天由接種糖度10 °Bx降至5.5 °Bx，12#菌株降糖速率慢些，在第8天由接種糖度10 °Bx降至5.5 °Bx，而對照菌株降糖速率最慢，在第10天由接種糖度10 °Bx降至5.5 °Bx。經(jīng)計算，對照菌株的發(fā)酵速率為0.5 °Bx/d、10#菌株的發(fā)酵速率為1.5 °Bx/d、12#菌株的發(fā)酵速率為0.64 °Bx/d。

2.8出發(fā)菌株與變異菌株的發(fā)酵性能比較

表5　出發(fā)菌株與變異菌株最終發(fā)酵指標測定結(jié)果Table 5 Physicochemical indexes of fermentation products from variant and original strains

由表5可知，誘變后的10#菌株的真實發(fā)酵度比出發(fā)菌株高些，雙乙酰產(chǎn)量下降20.9%，酒精度上升。脈沖強光誘變處理并未對啤酒酵母的發(fā)酵度產(chǎn)生負面效應(yīng)，而是有所提高或保持原酵母菌株的優(yōu)良發(fā)酵性能。

3　結(jié) 論

本研究采用脈沖強光誘變啤酒酵母菌，并對抗性強的菌株的耐受性和發(fā)酵性進行測定，結(jié)果表明：脈沖強光可以篩選出發(fā)酵速率較高的10#和12#菌株。脈沖強光誘變處理并未對啤酒酵母的發(fā)酵度產(chǎn)生負面效應(yīng)，而是有所提高或保持原酵母菌株的優(yōu)良發(fā)酵性能。綜上所述，脈沖強光篩選出的菌株具有生產(chǎn)出優(yōu)良啤酒的能力。

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Mutagenic Effects of Pulsed Light Irradiation on Saccharomyces cerevis iae

ZHANG Baiqing, SUN Lanmeng
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Abstract:Pulsed light irradiation treatment was applied on Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) under varying conditions of voltage (1 000, 1 500, 2 000, 2 500, and 3 000 V) and pulse number (4, 8, 16, 32, and 48). A comparative analysis between the variant and original strains was performed for differences in flocculation ability, diacetyl production, physico-chemical properties of fermentation products and fermentation rate. Mutant strains 10# and 12# with good fermentation characteristics were obtained by primary and secondary screening. Our results showed that pulsed light irradiation did not negatively affect but maintained or even enhanced the fermentation performance of S. cerevisiae.

Key words:pulsed light; Saccharomyces cerevisiae; mutagenesis; variant strain; original strain

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507028

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0153-05

作者簡介：張佰清（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品工程技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用。E-mail：sybaiqingxl@sina.com

收稿日期：2014-05-19