陳 佳，楊詩(shī)穎，柯崇榕，黃建忠*

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350117）

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乳酸乳球菌生產(chǎn)γ-氨基丁酸條件的優(yōu)化

陳 佳，楊詩(shī)穎，柯崇榕，黃建忠*

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350117）

摘 要：采用析因設(shè)計(jì)和中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)乳酸乳球菌FJNU-GA1304產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的條件進(jìn)行優(yōu)化。完全析因設(shè)計(jì)優(yōu)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件為：pH 3.5、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h，谷氨酸鈉質(zhì)量濃度20 g/L和濕菌體質(zhì)量濃度25 g/L；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過篩選設(shè)計(jì)確定谷氨酸鈉、玉米漿粉和葡萄糖質(zhì)量濃度為主效因子。采用三因素三水平的中心組合試驗(yàn)對(duì)主效因子的交互作用進(jìn)行分析，結(jié)果表明：最佳的培養(yǎng)基組成為谷氨酸鈉9.50 g/L、玉米漿粉12.50 g/L、葡萄糖5.74 g/L、酵母膏5.00 g/L、K2HPO41.2 0 g/L、MgSO40.60 g/L。在最佳轉(zhuǎn)化條件和發(fā)酵培養(yǎng)基組合下，GABA產(chǎn)量最高達(dá)9.06 g/L，比優(yōu)化前4.80 g/L提高了88.8%。

關(guān)鍵詞：γ-氨基丁酸；乳酸乳球菌；析因設(shè)計(jì)；篩選設(shè)計(jì)；中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是由L-谷氨酸或其衍生物在谷氨酸脫羧酶的作用下脫羧而成的一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞中[1-3]。GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)，具有降血氨、抗焦慮、降血壓、治療糖尿病、改善腎機(jī)能和肝機(jī)能，促進(jìn)乙醇代謝和消臭，以及高效減肥等生理功能，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)中[4-9]。此外，GABA也作為飼料添加劑應(yīng)用于畜牧業(yè)中[10-12]。

目前，GABA生產(chǎn)主要是通過微生物進(jìn)行發(fā)酵[13]。乳酸菌是國(guó)際公認(rèn)的食品安全級(jí)細(xì)菌，2009年12月國(guó)家衛(wèi)生部已批準(zhǔn)GABA用于食品生產(chǎn)加工，因此大部分研究集中于利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA[14]。然而，乳酸菌屬于兼性厭氧菌，生物量較低，直接以谷氨酸鈉為底物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，底物殘留較多，增加了下游提取純化難度。林謙等[15]以10 g/L的谷氨酸鈉為底物利用Lactobacillus fermentum YS2液體發(fā)酵生產(chǎn)GABA，產(chǎn)量?jī)H為4.37 g/L；Ratanaburee等[16]以10 g/L的谷氨酸鈉為底物利用Lactobacillus plantarum DW12液體發(fā)酵生產(chǎn)GABA，產(chǎn)量也只有4.00 g/L。同時(shí)，乳酸菌是以有機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中還有微生物菌體、代謝物、蛋白和色素等多種雜質(zhì)，產(chǎn)品分離純化步驟繁雜、設(shè)備要求高、成本高。針對(duì)此問題，張婷[17]探討了兩步法合成GABA。第一步是發(fā)酵收集菌體，第二步是全細(xì)胞催化GABA。相對(duì)于發(fā)酵液而言，反應(yīng)液成分簡(jiǎn)單，不含大量有機(jī)成分，使產(chǎn)物分離純化較簡(jiǎn)單。同時(shí)具有生產(chǎn)周期較短、轉(zhuǎn)化率高及節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用兩步法生產(chǎn)GABA，探討細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件對(duì)GABA產(chǎn)量和培養(yǎng)基組分對(duì)谷氨酸脫羧酶活性的影響，從而為規(guī)?；a(chǎn)GABA提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）FJNU-GA1304，由工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心（福建師范大學(xué)）保藏。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）美國(guó)Sigma公司；異硫氰酸苯酯美國(guó)Aladdin公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Sinence公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

U-3000高效液相色譜系統(tǒng)（配有DAD檢測(cè)器）美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏10、酵母膏5、葡萄糖20、蛋白胨10、K2HPO42、無水乙酸鈉 5、檸檬酸三銨2、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·4H2O 0.25，吐溫-80 1 mL，pH 6.8。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏10、葡萄糖10、K2HPO41、MgSO4·7H2O 1、谷氨酸鈉5，pH 7.0。

1.4液體培養(yǎng)條件

按體積分?jǐn)?shù)5%的初始接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為35 mL/150 mL，溫度為30 ℃，靜置培養(yǎng)12 h。

1.5GABA產(chǎn)量的測(cè)定

發(fā)酵液離心，收集菌體，稱取濕菌體質(zhì)量，計(jì)算對(duì)應(yīng)的生物量。采用含有10 g/L谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液重懸菌體，使最終轉(zhuǎn)化液中濕菌體質(zhì)量濃度為4 g/100 mL，在一定條件下反應(yīng)后，以沸水浴10 min結(jié)束反應(yīng)，10 000×g離心5 min，取上清液測(cè)定GABA的質(zhì)量濃度，是以異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）作為衍生劑通過高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定[18]。

色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相：V（醋酸鈉緩沖液）∶V（乙腈）=4∶1，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

使用N=20完全析因試驗(yàn)對(duì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)化的pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、谷氨酸鈉和濕菌體的質(zhì)量濃度5 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，見表1。

表1　細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件因素Table 1 Level and code of conversion conditions used for full factorial design

1.7培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

1.7.1 單因素試驗(yàn)和篩選設(shè)計(jì)

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以10 g/L的可溶性淀粉、蔗糖、丁二酸鈉、葡萄糖、乳糖和果糖作為單一碳源，確定最佳碳源；再分別以10 g/L的硝酸鈉、硫酸銨、玉米漿粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和胰蛋白胨作為單一氮源，確定最佳氮源。根據(jù)最適碳氮源修改初始發(fā)酵培養(yǎng)基組分，采用JMP中的N=16的篩選設(shè)計(jì)分析培養(yǎng)基組分中影響GABA產(chǎn)量的主效因素。

1.7.2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過最陡爬坡試驗(yàn)確定3 個(gè)主效因素的中心點(diǎn)，利用SAS 9.2軟件根據(jù)響應(yīng)面曲面設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定主效因素的最佳水平。

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

圖1　細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of optimal conversion conditions

細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA實(shí)際上是利用細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）將運(yùn)輸通過細(xì)胞壁進(jìn)入胞內(nèi)的谷氨酸進(jìn)行脫羧形成。如圖1所示，通過標(biāo)準(zhǔn)最小二乘法構(gòu)建模型的線性擬合表明，pH值是最主要的影響因素，當(dāng)pH值為5.5時(shí)，GABA產(chǎn)量均低于0.124 g/L；其次是谷氨酸鈉，在pH 3.5的基礎(chǔ)上，當(dāng)谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，GABA產(chǎn)量均大于3 g/L；且當(dāng)pH 3.5時(shí)，底物質(zhì)量濃度20 g/L時(shí)，反應(yīng)溫度為40 ℃更有利于提高GABA的產(chǎn)量。這是因?yàn)槿魏蚊付夹枰诤线m的pH值和溫度條件下才能體現(xiàn)出其最大的活性，而且在酸性條件下細(xì)菌需要通過將胞外的谷氨酸運(yùn)入胞內(nèi)脫羧生成氨基丁酸并消耗一質(zhì)子來維持自身pH值[19]。因此，較低的pH值和高質(zhì)量濃度的谷氨酸鈉有利于GABA的生成。此外，較高的溫度能夠提高細(xì)胞壁的通透性，有利于谷氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因而最終確定pH 3.5、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、谷氨酸鈉質(zhì)量濃度20 g/L和濕菌體質(zhì)量濃度25 g/L作為細(xì)胞轉(zhuǎn)化GABA的條件。

2.2碳氮源的選擇

圖2　不同碳源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on GABA production

圖3　不同氮源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on GABA production

細(xì)胞內(nèi)單位細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率受培養(yǎng)基組分的影響，因此需要對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。首先探討最適的碳氮源，如圖2所示，以乳糖為碳源最有利于提高單位細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率，GABA產(chǎn)量最高達(dá)到5.93 g/L；其次為葡萄糖5.33 g/L。通過方差分析和多重比較表明，不同碳源對(duì)GABA的產(chǎn)量以及生物量的影響差異顯著?？紤]到葡萄糖有利于菌體生長(zhǎng)且價(jià)格低廉，故選定葡萄糖作為碳源。

以葡萄糖為碳源，分析不同氮源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。如圖3所示，以玉米漿粉、胰蛋白胨或酵母膏作為氮源時(shí)，GABA產(chǎn)量較高，分別為6.98、6.02 g/L和5.23 g/L。黃桂東等[20]發(fā)現(xiàn)采用復(fù)合氮源有利于菌體內(nèi)單位細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的提高，從而提高GABA的產(chǎn)量。由于胰蛋白胨價(jià)格高昂，因此選取玉米漿粉和酵母膏作為復(fù)合氮源。考慮到玉米漿粉最有利于提高GABA產(chǎn)量，故確定玉米漿粉和酵母膏的質(zhì)量濃度分別為7 g/L和3 g/L。

2.3篩選設(shè)計(jì)

培養(yǎng)基組分較多，需先對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行擬合分析，篩選出主效組分。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用N=16的篩選設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2所示。

表2　主效組分的篩選設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Screening design of medium components and results

利用JMP 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和因素效應(yīng)分析，結(jié)果表明，谷氨酸鈉和玉米漿粉質(zhì)量濃度對(duì)GABA產(chǎn)量影響最大（P＜0.01），其次為葡萄糖和酵母膏質(zhì)量濃度（P＜0.05）。這是由于GABA是由谷氨酸脫羧酶（GAD）脫羧形成的，而GAD是誘導(dǎo)酶，需要一定質(zhì)量濃度的谷氨酸鈉作為誘導(dǎo)物。此外，回歸分析表明葡萄糖和MgSO4為負(fù)效應(yīng)因素，適當(dāng)減少其質(zhì)量濃度有利于提高GABA產(chǎn)量。

2.4最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)篩選設(shè)計(jì)結(jié)果，確定谷氨酸鈉、玉米漿粉和葡萄糖為主效因子進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，逼近GABA的最大產(chǎn)量區(qū)，而酵母膏、K2HPO4和MgSO4的質(zhì)量濃度分別設(shè)為5、1.2 g/L和0.6 g/L。由表3可知，第5組試驗(yàn)的GABA產(chǎn)量最高，達(dá)到8.61 g/L。因此，選擇葡萄糖、玉米漿粉和谷氨酸鈉質(zhì)量濃度分別為6、11.2 g/L和11 g/L時(shí)作為中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表3　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Steepest aasscent design with experimental values of GABA yield

2.5中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

葡萄糖、玉米漿粉和谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。16 組試驗(yàn)點(diǎn)中有14 個(gè)析因點(diǎn)，2 個(gè)用以估算試驗(yàn)誤差的零點(diǎn)。利用SAS 9.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)GABA響應(yīng)值均在95%的置信區(qū)間內(nèi)，且殘差在±5 RSD之間，正態(tài)分布呈一直線，表明該試驗(yàn)結(jié)果可信、沒有噪音數(shù)據(jù)。

2.5.2 中心組合試驗(yàn)顯著性檢驗(yàn)

方差分析（表5）表明，不同組分間的差異顯著，表明試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，通過擬合回歸構(gòu)建二階響應(yīng)模型是可行的，回歸模型P值小于0.01且相關(guān)系數(shù)R2=96.40%（＞90%），表明該模型極顯著且擬合良好，可用于分析預(yù)測(cè)不同組分的質(zhì)量濃度配比對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。

表5　二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

由表5中的P值可知，葡萄糖、玉米漿粉及其與谷氨酸鈉的交互作用對(duì)GABA產(chǎn)量有極顯著影響（P＜0.01）；谷氨酸鈉和葡萄糖二次項(xiàng)對(duì)GABA產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05），表明不同質(zhì)量濃度的葡萄糖、玉米漿粉和谷氨酸鈉對(duì)GABA產(chǎn)量的影響呈曲面關(guān)系，交互項(xiàng)作用顯著，二次項(xiàng)影響較小。根據(jù)模型預(yù)測(cè)分析，當(dāng)葡萄糖為5.74 g/L、玉米漿粉為12.5 g/L和谷氨酸鈉為9.50 g/L時(shí)，GABA最高產(chǎn)量可達(dá)9.47 g/L。

2.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)中心組合試驗(yàn)確定的最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，以優(yōu)化前的條件做對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。3 次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的GABA平均產(chǎn)量為9.06 g/L，與預(yù)測(cè)產(chǎn)量9.47 g/L相差不到5%，說明模型較好地?cái)M合了不同組分配比對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。

3　結(jié) 論

本研究對(duì)一株具有產(chǎn)GABA能力的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）FJNU-GA1304進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件和培養(yǎng)基組分的優(yōu)化。通過完全析因設(shè)計(jì)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，確定了有利于提高GABA產(chǎn)量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件是pH 3.5、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、谷氨酸鈉質(zhì)量濃度20 g/L和濕菌體質(zhì)量濃度25 g/L。GABA的產(chǎn)量直接受谷氨酸脫羧酶影響[21]。要提高GABA的產(chǎn)量，首先應(yīng)獲得較高產(chǎn)量的GAD，提高單位細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，即培養(yǎng)基組分必須有利于細(xì)胞的增殖，同時(shí)菌體還應(yīng)具有較高的GAD活性。因此，在優(yōu)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合中心組合試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，以期提高單位質(zhì)量菌體內(nèi)的GAD產(chǎn)量，最終提高GABA的產(chǎn)量。優(yōu)化后得到有利于提高GABA生成量的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為谷氨酸鈉9.50 g/L、玉米漿粉12.50 g/L、葡萄糖5.74 g/L、酵母膏5.00 g/L、K2HPO41.20 g/L、MgSO40.60 g/L。在最佳轉(zhuǎn)化條件和發(fā)酵培養(yǎng)基組合下，轉(zhuǎn)化液中GABA產(chǎn)量為9.06 g/L，比優(yōu)化前4.80 g/L提高了88.8%。

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Optimization of Conditions for the Production of γ-Aminobutyric Acid by Lactococcus lactis

CHEN Jia, YANG Shiying, KE Chongrong, HUANG Jianzhong*

(National-Local United Engineering Research Centre of Industrial Microorganism Fermentation Technology, College of Life Science Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China)

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Abstract:Factorial design and central composite design were applied to optimize the yield of γ-aminobutyric acid (GABA) produced by cultured Lactococcus lactis cells from monosodium glutamate in a buffer solution. A full factorial design was used to optimize the conversion conditions as 40 ℃, pH 3.5 and 24 h. Using single factor designs, sodium glutamate, corn steep powder and glucose concentration were identified as major factors affecting GABA production. The interaction effect of the major factors at three levels each was analyzed by central composite design. The results showed that the optimal medium for Lactococcus lactis consisted of 9.5 g/L sodium glutamate, 5.74 g/L glucose, 12.50 g/L corn steep powder, 5.00 g/L yeast extract, 1.20 g/L K2HPO4and 0.60 g/L MgSO4. Under these conditions, the yield of GABA was 9.06 g/L, which was increased by 88.8% when compared with that (4.80 g/L) before optimization.

Key words:γ-aminobutyric acid; Lactococcus lactis; factorial design; screening design; central composite design

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507027

中圖分類號(hào)：TQ922

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0148-05

*通信作者：黃建忠（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锕δ芑?。E-mail：hjz@fjnu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：陳佳（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：happierjia@163.com

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2012N0013）

收稿日期：2014-05-04