史紅征 吳彥彥 史曉靜 鐘凱 魏旭穎 朱會(huì)霞

γ-氨基丁酸是一種天然的、食品級(jí)的、對(duì)人體具有多種功效的非蛋白質(zhì)氨基酸，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化脫羧而來。2009年，原衛(wèi)生部允許γ-氨基丁酸在食品生產(chǎn)加工中適量添加使用。食品工業(yè)中生產(chǎn)γ-氨基丁酸常用微生物發(fā)酵法，紅曲霉是其中最常用的微生物。本文通過研究發(fā)酵對(duì)紅曲霉γ-氨基丁酸生物合成的影響，為紅曲霉高產(chǎn)γ-氨基丁酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供依據(jù)。

一、菌種

紅曲霉菌種保存于衡水學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.紅曲霉的液體培養(yǎng)。將斜面紅曲霉菌株接種至液體豆芽汁培養(yǎng)基中，在30℃條件下培養(yǎng)5d，將菌絲球再次轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基后分成2組，一組在搖床上經(jīng)30℃、150r/min震蕩培養(yǎng);另一組經(jīng)30℃靜置培養(yǎng)，每日觀察。

2.γ-氨基丁酸的含量測定。按照劉夢云等《GABA產(chǎn)生菌的篩選以及檢測方法的比較研究》，測定γ-氨基丁酸的含量。

3.培養(yǎng)基的優(yōu)化。前期實(shí)驗(yàn)所用的是豆芽汁、葡萄糖和酵母膏的液體培養(yǎng)基，從成本考慮改為豆粕粉、大米粉和酵母膏的液體培養(yǎng)基，做正交試驗(yàn)確定培養(yǎng)基。

4.分析優(yōu)化后的培養(yǎng)基的最佳轉(zhuǎn)速。優(yōu)化的培養(yǎng)基中因?yàn)榧尤肓硕蛊煞酆痛竺追鄱兊谜吵?，將?yōu)化培養(yǎng)基接種紅曲霉菌種，然后分別在90r/min、120r/min、? ? ? ? ? ? ? 150r/min、180r/min、210r/min的轉(zhuǎn)速下，在搖床上經(jīng)30℃培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)基的變化，并測定γ-氨基丁酸的含量以確定最佳轉(zhuǎn)速。

三、結(jié)果與分析

1.紅曲霉靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)液體培養(yǎng)狀態(tài)的差異。（1）靜置培養(yǎng)的紅曲霉液體培養(yǎng)物因?yàn)闆]有搖床的震蕩分散作用，形成的菌絲粘連為片狀且為白色。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，紅曲霉菌絲逐漸增多且成團(tuán)，菌絲團(tuán)中間的顏色也變?yōu)榧t色，邊緣的菌絲仍為白色，培養(yǎng)液的顏色變化不明顯。（2）在搖床中培養(yǎng)的液體培養(yǎng)物由于震蕩、分散和回旋的作用，發(fā)酵液中供氧充足有利于菌絲的擴(kuò)增，形成了大量的菌絲球。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌絲球漸漸變大，其顏色由白色變?yōu)榧t色;培養(yǎng)液的顏色漸漸加深，最后變?yōu)樽霞t色，其主要是由紅曲色素的積累增加所導(dǎo)致。

2.紅曲霉液體培養(yǎng)菌絲觀察。（1）觀察不同培養(yǎng)時(shí)間下?lián)u床菌絲的形態(tài)，初期菌絲有橫膈、無色透亮;中期菌絲開始出現(xiàn)無規(guī)則的分支，菌絲之間網(wǎng)狀聯(lián)合、分布密集;培養(yǎng)后期菌絲體開始形成孢子并不斷生長，并有部分孢子萌發(fā)。（2）靜置狀態(tài)下培養(yǎng)的紅曲霉菌絲分支較少，且菌絲分布稀疏、密度較小，更易觀察。通常在梗頂端生出倒梨形或球形的分生孢子。

3.γ-氨基丁酸含量的測定。（1）隨著紅曲霉培養(yǎng)時(shí)間的增加，搖床培養(yǎng)液和靜置培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸生成量均逐漸增多，在培養(yǎng)至第5天時(shí)均達(dá)到最大值（搖床培養(yǎng)液和靜置培養(yǎng)液中分別是113.9mg/L和93.5mg/L），并且搖床培養(yǎng)液中的γ-氨基酸含量高于靜置培養(yǎng)液。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)液和靜置培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸含量反而下降。（2）每天將紅曲霉搖床培養(yǎng)基和靜置培養(yǎng)基過濾后獲得菌絲，測定菌絲中的γ-氨基丁酸含量，其也隨培養(yǎng)天數(shù)的增長而增加。但菌絲中γ-氨基丁酸含量達(dá)到最大值的時(shí)間與培養(yǎng)液有差異，在第6天時(shí)γ-氨基丁酸達(dá)到最大值（搖床培養(yǎng)菌絲和靜置培養(yǎng)菌絲中分別是101.3mg/L和94.6mg/L）。

搖床培養(yǎng)液和菌絲中的γ-氨基丁酸含量均分別高于靜置培養(yǎng)液和菌絲中的含量，原因在于紅曲霉是極好氧微生物，搖床培養(yǎng)比靜置培養(yǎng)能提供更多氧，有利于基質(zhì)轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸。因此，紅曲霉合成γ-氨基丁酸的最佳方式是搖床培養(yǎng)，在此條件下最佳發(fā)酵天數(shù)是5d。綜上可知，搖床培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸含量高于搖床菌絲。搖床培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸含量高，并且能快速地應(yīng)用工業(yè)方法提取，而從菌絲中提取γ-氨基丁酸的工藝復(fù)雜、消耗較大，在工業(yè)生產(chǎn)中并不實(shí)用。

4.優(yōu)化液體培養(yǎng)基。對(duì)R值（表1）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，豆粕粉的影響最大，大米粉的影響較小，而酵母膏對(duì)γ-氨基丁酸的產(chǎn)量基本沒有影響。分析K值，確定三種原料的最佳比例是A2B2C1，即每1L培養(yǎng)基中加入豆粕粉20g、大米粉40g、酵母膏5g。然而，A2B2C1組合并未在正交實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)，因此需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)，A2B2C1組合的γ-氨基丁酸含量為240.31mg/L，高于正交實(shí)驗(yàn)中最高量233.41mg/L，說明正交實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)組合的確為γ-氨基丁酸含量最高的培養(yǎng)基配比。

5.搖床轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲霉合成γ-氨基丁酸的影響。90r/min培養(yǎng)物中基本沒有泡沫，γ-氨基丁酸含量為182.7mg/L;120r/min和150r/min培養(yǎng)物中的泡沫很少，γ-氨基丁酸含量分別為216.3mg/L和260.1mg/L;180r/min培養(yǎng)物中，γ-氨基丁酸含量為為268.7mg/L，但產(chǎn)生的泡沫很多，有染菌的危險(xiǎn)，而且γ-氨基丁酸產(chǎn)量與150r/min產(chǎn)量相差不多;210r/min培養(yǎng)物中的γ-氨基丁酸含量為223.6mg/L，但產(chǎn)生太多的泡沫，損失較大。因此，150r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)是生產(chǎn)γ-氨基丁酸的最佳轉(zhuǎn)速條件。

四、結(jié)論

本文分析了培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成、搖床轉(zhuǎn)速等因素對(duì)紅曲霉中γ-氨基丁酸合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為紅曲霉合成γ-氨基丁酸的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

基金項(xiàng)目：國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：202010101008。

作者簡介：史紅征（2000-），女，河北保定人，在讀本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通信作者：朱會(huì)霞（1977-），女，河北景縣人，教授，博士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、中藥發(fā)酵。