蔣云露，王 猛，常 偉，李明元，王 衛(wèi)，馬 力，饒 瑜,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.通威集團(tuán)三文魚研究所，四川 都江堰 611800；3.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106）

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傳統(tǒng)風(fēng)吹肉加工過(guò)程中的微生物演替及優(yōu)勢(shì)菌群分析

蔣云露1，王 猛1，常 偉2，李明元1，王 衛(wèi)3，馬 力1，饒 瑜1,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.通威集團(tuán)三文魚研究所，四川 都江堰 611800；3.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106）

摘 要：研究傳統(tǒng)風(fēng)吹肉在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的不同階段中微生物的種類、優(yōu)勢(shì)菌群及其數(shù)量變化情況。選用7 種培養(yǎng)基對(duì)不同加工階段風(fēng)吹肉樣品中的不同微生物進(jìn)行分離純化，并對(duì)其進(jìn)行16S或18S rDNA分子生物學(xué)鑒定，鑒定得到加工過(guò)程存在于樣品肉中的優(yōu)勢(shì)微生物9 種，其中細(xì)菌7 種和真菌2 種。結(jié)果表明：在傳統(tǒng)風(fēng)吹肉生產(chǎn)過(guò)程中，料泡引起 微生物大量死亡后，風(fēng)吹肉樣品中的各類微生物總數(shù)在風(fēng)吹前10 d持續(xù)上升，在中后期達(dá)到穩(wěn)定。以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）為主的乳酸菌是川味風(fēng)吹肉風(fēng)吹過(guò)程中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，其次是以巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）為主的葡萄球菌，漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）次之。此外，芽孢桿菌（Bacillus spp.）和水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）為川味風(fēng)吹肉制作過(guò)程中的主要腐敗菌，但隨著風(fēng)吹過(guò)程顯著減少。

關(guān)鍵詞：風(fēng)吹肉；菌群動(dòng)態(tài)變化；優(yōu)勢(shì)微生物；16S rDNA；18S rDNA

風(fēng)吹肉制品，是人們世代相傳發(fā)展起來(lái)的傳統(tǒng)肉類制品，具有加工簡(jiǎn)易、風(fēng)味獨(dú)特、便于貯藏等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。風(fēng)吹肉香味濃郁、色澤金黃或紅棕、咸鮮適口，是我國(guó)南方冬季長(zhǎng)期貯藏的腌肉制品。而其作為一種傳統(tǒng)手工制作的肉制品，必須對(duì)其工藝進(jìn)行改良才能適應(yīng)現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)的需要。開(kāi)展風(fēng)吹肉中微生物種類、數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化研究是改進(jìn)傳統(tǒng)加工工藝、控制產(chǎn)品質(zhì)量、推動(dòng)傳統(tǒng)手工加工向現(xiàn)代化生產(chǎn)轉(zhuǎn)變的客觀需要[1]。

風(fēng)吹肉制品制作過(guò)程中，微生物發(fā)酵是影響風(fēng)吹肉制品成熟度、口感風(fēng)味的重要環(huán)節(jié)。發(fā)酵不成熟的產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，滋生的一些腐敗微生物更是會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成威脅。目前，對(duì)傳統(tǒng)腌臘肉制品的微生物特性、風(fēng)味形成機(jī)理、風(fēng)味調(diào)控技術(shù)、風(fēng)味成分等問(wèn)題的研究成果表明，火腿、發(fā)酵香腸等中等水分含量的傳統(tǒng)腌臘肉制品中的常見(jiàn)微生物有乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、霉菌、酵母等[2-3]。本研究采用分子生物學(xué)方法，對(duì)風(fēng)吹肉不同發(fā)酵時(shí)期的微生物進(jìn)行分離鑒定，了解產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化，為推動(dòng)傳統(tǒng)風(fēng)吹肉制品加工的轉(zhuǎn)型提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、培養(yǎng)基與試劑

四川省雅安市某公司提供傳統(tǒng)風(fēng)吹肉生產(chǎn)工藝中不同階段的肉樣，包括：a.新鮮原料肉；b.料泡1 d后的肉；c.料泡1 d風(fēng)吹2 d后的肉；d.風(fēng)吹10 d的肉；e.風(fēng)吹20 d的肉；f.風(fēng)吹30 d的成品肉。

MRS 瓊脂培養(yǎng)基、M17瓊脂培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、虎紅瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基 北京奧博興生物科技有限公司。

DNA Marker、Taq DNA連接酶、dNTP、基因組提取試劑盒、基因組純化試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；RNase A 美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1菌株分離

用無(wú)菌剪刀剪取a～f樣品各10 g，分別與90 mL無(wú)菌生理鹽水混合，超聲波振蕩30 min。分別吸取100 μL的混合液涂布到MRS、M17、PCA、虎紅、VRBA、強(qiáng)化梭菌及甘露醇氯化鈉固體培養(yǎng)基上。涂布好后至于相應(yīng)溫度（MRS、M17、PCA、VRBA、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基于37 ℃，虎紅瓊脂于30 ℃，甘露醇氯化鈉瓊脂于35 ℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，參照GB 4789.15—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并記錄菌落形態(tài)。

1.3.2 菌株的鑒定

對(duì)不同形態(tài)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)并挑取接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，相應(yīng)溫度下?lián)u床培養(yǎng)24～48 h，得到濃度約106CFU/mL的菌液。采用相應(yīng)基因組提取試劑盒，對(duì)各菌株培養(yǎng)液進(jìn)行總基因組的提取，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果。細(xì)菌樣品以各基因組為模版，以Eu27F和1490R為引物，擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，進(jìn)行16S rDNA片段的擴(kuò)增。真菌樣品以NS1和NS4 為18S rDNA擴(kuò)增引物，擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，進(jìn)行18S rDNA片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后送上海華津生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，有關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1　16S rDNA、18S rDNA PCR擴(kuò)增引物序列表Table 1 Primers uused for PCR amplification of 16S rDNA and 18S rDNA

測(cè)序序列于NCBI GenBank Database中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1風(fēng)吹肉加工過(guò)程中微生物總數(shù)的變化

有研究發(fā)現(xiàn)，四川臘肉、自然風(fēng)干發(fā)酵香腸以及培根火腿中的微生物種類主要有：酵母菌、乳酸菌、葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌以及腸桿菌等[4-6]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇了相應(yīng)培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行分離篩選。選擇MRS與M17培養(yǎng)基用于乳酸菌的分離篩選，虎紅培養(yǎng)基用于真菌類的分離篩選，VRBA培養(yǎng)基用于腸道菌群微生物的分離篩選，強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基用于分離篩選梭菌類，甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基用于分離篩選葡萄球菌。

圖1　風(fēng)吹肉生產(chǎn)過(guò)程中微生物總數(shù)變化Fig.1 Microbial amounts in meat samples during air-drying process

由圖1可知，新鮮肉中的微生物總數(shù)為5.16（lg（CFU/g）），在料泡結(jié)束時(shí)微生物總數(shù)急劇減少到最低值。風(fēng)吹肉醬料的鹽含量一般為8%～10%，在鮮肉料泡過(guò)程中，醬料的高鹽濃度形成高滲環(huán)境，造成微生物脫水死亡，泡料后微生物總數(shù)降為4.72（lg（CFU/g））。陳美春等[4]也報(bào)道在四川臘肉生產(chǎn)過(guò)程中，腌制會(huì)使鮮肉中的微生物數(shù)量降低1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)。產(chǎn)品料泡結(jié)束后立即將樣品放在室外風(fēng)吹，料泡過(guò)程中存活的微生物及外界環(huán)境中附著到肉上的微生物開(kāi)始大量繁殖，微生物總數(shù)量隨著風(fēng)吹時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。在風(fēng)吹初期（前10 d），微生物數(shù)量增長(zhǎng)較快，達(dá)到5.08 （lg（CFU/g））；風(fēng)吹10～20 d，微生物數(shù)量相對(duì)平穩(wěn)；風(fēng)吹后期（20～30 d），微生物數(shù)量有所下降，為4.93 （lg（CFU/g））。

2.2風(fēng)吹肉生產(chǎn)過(guò)程中不同培養(yǎng)基上的微生物數(shù)量

圖2　風(fēng)吹肉生產(chǎn)過(guò)程中不同培養(yǎng)基上的微生物總數(shù)Fig.2 Microbial amounts in different media during air-drying process

由圖2A可知，MRS、M17培養(yǎng)基中的微生物總數(shù)即乳酸菌數(shù)變化趨勢(shì)類似。在料泡過(guò)程中，2 種培養(yǎng)基上的乳酸菌數(shù)從最初的4.10、4.72 （lg（CFU/g））分別降至3.58、4.48 （lg（CFU/g））。風(fēng)吹前2 d，微生物總數(shù)保持一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)，在風(fēng)吹2～10 d時(shí)出現(xiàn)了上漲的趨勢(shì)，在第10天分別達(dá)到：4.10 （lg（CFU/g））（MRS）、4.91 （lg（CFU/g））（M17）。乳酸菌數(shù)逐漸增多成為優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)分泌大量乳酸等代謝產(chǎn)物，改變產(chǎn)品風(fēng)味口感的同時(shí)也會(huì)一定程度上抑制其他微生物的生長(zhǎng)，乳酸菌對(duì)食品的保護(hù)作用主要是由于一些活性代謝產(chǎn)物的生成，比如有機(jī)酸（乳酸、醋酸、甲酸、丙酸、丁酸等），可通過(guò)降低體系的pH值來(lái)抑制其他微生物生長(zhǎng)[7]。風(fēng)吹中期（風(fēng)吹10～20 d），兩種平板上的乳酸菌數(shù)量均保持基本穩(wěn)定的狀態(tài)，而在風(fēng)吹后期（風(fēng)吹20～30 d），這兩種平板上的微生物數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別從4.11 （lg（CFU/g））（MRS）和4.90 （lg（CFU/g））（M17）下降至3.90 （lg（CFU/g））（MRS）和4.78 （lg（CFU/g））（M17）。

由圖2B可知，虎紅培養(yǎng)基、VRBA培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基這3 種培養(yǎng)基中的微生物總數(shù)在料泡及風(fēng)吹前期的變化趨勢(shì)類似。由于料泡時(shí)使用的醬料含鹽量高，高滲環(huán)境會(huì)使微生物細(xì)胞大量脫水死亡，因此虎紅培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基上的微生物總數(shù)分別從最初的4.30、4.78 （lg（CFU/g））迅速降至3.86、3.73 （lg（CFU/g））。料泡結(jié)束到風(fēng)吹2 d之間，微生物重新開(kāi)始大量繁殖，微生物總數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，3 種培養(yǎng)基上的細(xì)菌均增加為4.36 （lg（CFU/g））（虎紅）、4.29 （lg（CFU/g））（VRBA）；4.13（lg（CFU/g））（強(qiáng)化梭菌）。一段時(shí)間后其生長(zhǎng)所需某些營(yíng)養(yǎng)成分消耗殆盡，加之受到乳酸菌等優(yōu)勢(shì)菌種所產(chǎn)生的抑制作用，其數(shù)量開(kāi)始逐漸下降，分別降至4.08 （lg（CFU/g））（虎紅）、0 （lg（CFU/g））（VRBA）、3.66 （lg（CFU/g））（強(qiáng)化梭菌）。在風(fēng)吹后期（風(fēng)吹20～30 d）這3 種培養(yǎng)基上的細(xì)菌或真菌數(shù)量均基本保持穩(wěn)定。

由圖2C可知，甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基中的微生物總數(shù)變化情況較為特殊，這是因?yàn)橐恍┢咸亚蚓軌蚰褪芨邼舛鹊柠}含量。因此在料泡過(guò)程中，其他菌群的生長(zhǎng)均受到抑制，而葡萄球菌被抑制程度則較弱。葡萄球菌在腌制過(guò)程中的變化趨勢(shì)與陳美春等[4]的結(jié)論一致。在醬料腌制過(guò)程中，葡萄球菌的數(shù)量呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)，逐步增加達(dá)到3.62 （lg（CFU/g））。風(fēng)吹前2 d，由于真菌、腸道菌、梭菌的增加，形成了種間競(jìng)爭(zhēng)，從而破壞了葡萄球菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)，使葡萄球菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降狀態(tài)。在之后的風(fēng)吹初期，真菌、腸道菌、梭菌的數(shù)量逐漸減少，種間競(jìng)爭(zhēng)也逐漸減弱，這使得葡萄球菌的數(shù)量再一次出現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，達(dá)到4.04 （lg（CFU/g）），趙俊仁等[5]在自然發(fā)酵風(fēng)干腸發(fā)酵3～6 d時(shí)，也曾發(fā)現(xiàn)葡萄球菌出現(xiàn)增長(zhǎng)的情況。在風(fēng)吹10～30 d的過(guò)程中，葡萄球菌的數(shù)量呈連續(xù)緩慢下降狀態(tài)，最終達(dá)到3.90 （lg（CFU/g））。

2.3優(yōu)勢(shì)菌株的分離與菌落形態(tài)

篩選出在風(fēng)吹肉加工過(guò)程中一直存在或者在某些階段數(shù)量較多的菌種，對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的分離鑒定，挑選菌株形態(tài)如表2所示。

表2　挑取菌株的菌落形態(tài)Table 2 Colony morphology of selected strains

在各種培養(yǎng)基上各挑取1～2 個(gè)典型單菌落來(lái)進(jìn)行鑒定。其中，真菌在前期用虎紅培養(yǎng)基進(jìn)行分離，后期點(diǎn)種到麥芽汁培養(yǎng)基上進(jìn)行形態(tài)觀察。M17培養(yǎng)基上挑取菌株F1，PCA培養(yǎng)基上挑取菌株F2、F3，強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基上挑取菌株F4、F5、F6，VRBA培養(yǎng)基上挑取菌株F7、F8，甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基上挑取菌株F9、F10、F11，麥芽汁培養(yǎng)基上挑取菌株F12、F13。

2.4生產(chǎn)過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌株的鑒定

圖3　細(xì)菌（A）和真菌（B、C）總基因組電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of genome DNA of bacteria (A) and fungi (B, C)

由圖3可知，對(duì)細(xì)菌及真菌總基因組進(jìn)行電泳，條帶清晰，與Marker進(jìn)行比較后可以發(fā)現(xiàn)，樣品條帶處于15 000 bp以上，因此可以確定總基因組提取成功。圖4A、4B分別表示16S rDNA PCR及18S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖，可以看出樣品條帶均處于1 000～2 000 bp之間。16S rDNA擴(kuò)增片段約為1 540 bp，18S rDNA擴(kuò)增片段約為1 800 bp，因此可以確定16S rDNA PCR及18S rDNA PCR擴(kuò)增成功。

圖4　16S rDNA（A）和18S rDNA（B）PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of PCR-amplified products of 16S rDNA (A) and 18S rDNA (B)

圖5　細(xì)菌（A）和真菌（B）系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of bacteria (A) and fungus (B)

菌株測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。分析可知F2、F7及F11菌為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），F(xiàn)8菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），F(xiàn)10菌為克氏葡萄球菌（Staphylococcus kloosii），F(xiàn)3菌為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），F(xiàn)9菌為巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri），F(xiàn)1菌為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），F(xiàn)4、F5及F6菌均為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis），F(xiàn)12菌為漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），F(xiàn)13為解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。這些微生物在風(fēng)吹肉制作過(guò)程中的數(shù)量變化如圖6所示。

圖6　不同微生物在風(fēng)吹肉生產(chǎn)過(guò)程中的數(shù)量變化Fig.6 Microbial amounts in different cultures of meat samples during air-drying process

作為許多食品自然發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群，乳酸菌被認(rèn)為是安全的[8]，同時(shí)其作為發(fā)酵劑也在制作發(fā)酵蔬菜、乳制品和肉制品等食品的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9-10]。由圖6A可知，在整個(gè)風(fēng)吹肉加工過(guò)程中，乳酸乳球菌基本處于優(yōu)勢(shì)地位。在料泡階段，乳酸乳球菌受到高濃度鹽的影響，數(shù)量迅速下降50%；在風(fēng)吹初期（前10 d），乳酸乳球菌總體呈現(xiàn)一個(gè)先下降后上升的趨勢(shì)，乳酸乳球菌適應(yīng)新的環(huán)境開(kāi)始重新生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到4.73（lg（CFU/g））。在風(fēng)吹中期及后期（風(fēng)吹10～30 d），乳酸乳球菌的數(shù)量在基本維持恒定的情況下稍有下降，最終降至4.72 （lg（CFU/g））。乳酸菌的數(shù)量變化情況與趙俊仁等[5]在風(fēng)吹發(fā)酵腸過(guò)程中得出的結(jié)果類似，其研究得出，在自然風(fēng)吹發(fā)酵腸的生產(chǎn)過(guò)程中，乳酸菌在風(fēng)吹前3 d呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而在之后的3～10 d則出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

圖6B為3 種葡萄球菌——巴氏葡萄球菌、克氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌在風(fēng)吹肉生產(chǎn)過(guò)程中的數(shù)量變化情況。其中最主要的是巴氏葡萄球菌，克氏葡萄球菌次之，腐生葡萄球菌數(shù)最少。在料泡過(guò)程中，巴氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌數(shù)量急劇下降，而克氏葡萄球菌則增加至3.43 （lg（CFU/g））。這可能是因?yàn)榭耸掀咸亚蚓鷮?duì)鹽濃度的耐受能力較高，也可能是因?yàn)獒u料中本身就帶有這種菌體，從而引入到了肉制品中。在風(fēng)吹前2 d，巴氏葡萄球菌數(shù)量迅速回升，從3.08 （lg（CFU/g））增加至4.13 （lg（CFU/g）），在風(fēng)吹2～10 d的過(guò)程中開(kāi)始下降，降到3.65 （lg（CFU/g）），而克氏葡萄球菌此期間逐漸成為優(yōu)勢(shì)葡萄球菌，并維持在4 （lg（CFU/g））。Kung等[11]曾在金槍魚臘腸中分離得到巴氏葡萄球菌，Bermúdez等[12]也曾從傳統(tǒng)香腸中分離得到了巴氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌。

圖6C為漢遜德巴利酵母和解脂耶氏酵母在風(fēng)吹肉的加工過(guò)程中的變化情況。在料泡過(guò)程中，解脂耶氏酵母由于受到醬料高鹽濃度的影響，數(shù)量開(kāi)始下降，減少量達(dá)到2.90 （lg（CFU/g））。而漢遜德巴利酵母變化狀況則與之相反，在風(fēng)吹前兩天呈現(xiàn)一定的上升趨勢(shì)，這可能是由醬料引入的，同時(shí)漢遜德巴利酵母的耐鹽性較高，而解脂耶氏酵母受鹽濃度的影響相對(duì)更敏感[13]。而在之后的風(fēng)吹過(guò)程中（2～30 d），漢遜德巴利酵母的數(shù)量則總體趨于減少的情況。從風(fēng)吹2 d時(shí)的3.91 （lg（CFU/g））減少至最終的3.48 （lg（CFU/g））。解脂耶氏酵母的數(shù)量在風(fēng)吹前20 d緩慢增加（從2.90（lg（CFU/g））增加至3.20 （lg（CFU/g））），在風(fēng)吹后10 d又緩慢下降（從3.20 （lg（CFU/g））降至3.08（lg（CFU/g））），在整個(gè)風(fēng)吹過(guò)程中，解脂耶氏酵母的數(shù)量基本保持恒定的狀態(tài)。這與秦丹等[14]在四川香腸加工貯藏過(guò)程中所發(fā)現(xiàn)的酵母變化情況類似，在加工貯藏后期，酵母數(shù)量基本不改變。

圖6D顯示的是短小芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌以及水生拉恩菌在風(fēng)吹肉生產(chǎn)過(guò)程中的數(shù)量變化情況。有報(bào)道稱，芽孢桿菌會(huì)在一定條件下引起軟包裝肉的變質(zhì)[15]。料泡階段使短小芽孢桿菌和水生拉恩菌急劇減少，但短小芽孢桿菌在風(fēng)吹前2 d數(shù)量有所上升，風(fēng)吹中后期其數(shù)量回落至2.78 （lg（CFU/g））。因此，芽孢桿菌是風(fēng)吹肉加工過(guò)程中需要防控的主要腐敗微生物。已有文獻(xiàn)報(bào)道在腌臘肉制品加工過(guò)程中腐敗或病原微生物數(shù)量有所下降的情況[16-17]，如金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌等病原菌在臘肉、培根等的加工或貯藏過(guò)程中有顯著減少的現(xiàn)象。

3　討 論

在肉品腌制過(guò)程中，由于微生物代謝活動(dòng)降低了pH值，使肉品得以保存同時(shí)改變了原料的質(zhì)地、氣味、顏色和成分，并賦予產(chǎn)品良好的風(fēng)味[4]。有報(bào)道稱，乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出來(lái)的微生物，是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌種。乳酸菌可以利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸而使pH值降低，產(chǎn)酸率高，耐酸性較強(qiáng)。乳酸菌可抑制一些致腐微生物生長(zhǎng)、減少腐敗、穩(wěn)定產(chǎn)品的質(zhì)量并提高產(chǎn)品的貨架期，改善肉制品的組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)發(fā)色，降低亞硝酸鹽殘留量[18]。微生物代謝亮氨酸生成3-甲基丁醛，與含硫化合物反應(yīng)，可產(chǎn)生類似培根的風(fēng)味；其中葡萄球菌可代謝亮氨酸生成3-甲基丁醛，3-甲基丁醛對(duì)人類的感覺(jué)閾值很低，對(duì)發(fā)酵肉制品的典型風(fēng)味有重要影響，可作為產(chǎn)香性能的量化指標(biāo)[19]。酵母菌有時(shí)可以促進(jìn)發(fā)酵后肉制品的風(fēng)味形成，還可以對(duì)腌臘肉制品本身的紅色起到一定的穩(wěn)定作用[13]。此外，酵母還可提高發(fā)酵肉制品中氨含量，并降低其中的乙酸和乳酸含量[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在料泡過(guò)程中除了由醬料引入或?qū)}濃度有較高耐受性的克氏葡萄球菌、漢遜德巴利酵母以及枯草芽孢桿菌外，其他菌株的生長(zhǎng)均受到較大的抑制。經(jīng)過(guò)料泡后，微生物重新開(kāi)始大量繁殖，乳酸乳球菌是最主要的優(yōu)勢(shì)菌種，其次是葡萄球菌（尤其以巴氏葡萄球菌占主導(dǎo)），酵母菌（漢遜德巴利酵母和解脂耶氏酵母）次之。乳酸菌在改變產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)，一定程度上抑制了其他微生物的生長(zhǎng)。雖然在風(fēng)吹肉制作前期有一定數(shù)量的腐敗菌芽孢桿菌和條件致病菌水生拉恩菌，隨著料泡和風(fēng)吹過(guò)程的進(jìn)行卻逐漸降低，但仍然需要在今后的加工過(guò)程中引起重視，加強(qiáng)生產(chǎn)過(guò)程中各個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)的管理，采取相應(yīng)手段控制腐敗微生物的生長(zhǎng)，避免對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成傷害。

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Microbial Community Succession and Dominant Microbial Population during the Processing Stages of Traditional Air-Dried Meat

JIANG Yunlu1, WANG Meng1, CHANG Wei2, LI Mingyuan1, WANG Wei3, MA Li1, RAO Yu1,*
(1. School of Food and Biotechnology, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Institute of Salmon, Tongwei Group Co. Ltd., Dujiangyan 611800, China; 3. Faculty of Biological Industry, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Abstract:The microbial population, diversity and dynamics of traditional air-drying meat during different processing stages were assessed. Seven culture media were used to separate different microorganisms from different air-drying meat samples. Nine species were selected as dominant microorganisms including seven species of bacteria and two species of fungi. 16S rDNA or 18S rDNA analysis was employed for species identifi cation. The results showed that following the microbial growth inhibition during the salted process, the population of different microbial communities in meat samples increased gradually during the fi rst 10 days and reached a stable level at the later stages of air-drying processing. Lactic acid bacteria based on Lactococcus lactis dominated the air-drying process, followed by Staphylococcus pasteuri, Debaryomyces hansenii and Yarrowia lipolytica. Furthermore, Bacillus spp. and Rahnella aquatilis were the major spoilage bacteria, but their amounts decreased signifi cantly during the air-drying processing. This study can provide a useful guidance for starter culture screening and safety control of traditional air-drying meat.

Key words:air-dried meat; microbial dynamics; dominant microorganisms; 16S rDNA; 18S rDNA

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507021

中圖分類號(hào)：TS251.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0111-06

*通信作者：饒瑜（1982—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：ryfish@163.com

作者簡(jiǎn)介：蔣云露（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ獭-mail：jiangyl0104@hotmail.com

基金項(xiàng)目：肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（13-R09）；西華大學(xué)“西華杯”大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2014136）；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（ycjj2014142）

收稿日期：2014-06-30