孫才云，方 玲，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

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香菜葉多酚氧化酶的分離純化與部分酶學(xué)性質(zhì)研究

孫才云，方 玲，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

摘 要：新鮮香菜葉經(jīng)勻漿、緩沖液提取、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析，獲得電泳純的多酚氧化酶。該酶比活力達(dá)到5 622.95 U/mg，酶活回收率為3.90%，純化倍數(shù)為126.08；全酶分子質(zhì)量為111.10 kD，亞基分子質(zhì)量為55.60 kD；最適溫度為37 ℃，最適pH值為6.5；在25～45 ℃及pH 6.0～7.0范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性；在最適條件下測得其Km值為4.04×10－2mol/L；甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿及檸檬酸、抗壞血酸、Ca2＋、Hg2＋、Ba2＋對其有抑制作用，Co2＋、Pb2＋對其具有一定的激活作用。

關(guān)鍵詞：香菜葉；多酚氧化酶；分離純化；性質(zhì)

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，EC1.10.3.1，PPO）是植物體內(nèi)普遍存在的一類銅結(jié)合酶。它是引起水果、蔬菜發(fā)生酶促褐變的主要酶類[1]。當(dāng)質(zhì)粒與細(xì)胞液泡的分區(qū)被打破，酚類和PPO接觸，在有氧情況下，酚類被PPO氧化成醌并聚合成褐色聚合物[2]。此外，PPO作為一種氧化還原酶還在光合作用中發(fā)揮作用，如調(diào)節(jié)葉綠體中有害的光氧化反應(yīng)速率，參與其中電子傳遞；PPO還可促進(jìn)傷口的愈合，也可增加植物對病原體的抗性[3]。

香菜（Coriandrum sativum）屬傘形科植物，又名蕪荽、胡菜等，是以莖和葉為菜肴調(diào)料的栽培種，為一年生草本植物[4]。其營養(yǎng)成分中胡蘿卜素和鐵的含量較高，是綠葉蔬菜中的佼佼者，并且富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、尼克酸、膳食纖維、維生素、視黃醇等營養(yǎng)物質(zhì)[4-5]。適于寒性體質(zhì)、胃弱體質(zhì)以及腸腑壅滯者食用，可用來治療胃脘冷痛、消化不良、麻疹不透等病癥，還有降血壓、美容等作用[4]，越來越被人們重視。有關(guān)PPO與植物褐變方面的研究已有不少報道[6-11]，但關(guān)于香菜PPO的研究尚未見報道。為此，本實驗以香菜葉片為材料，對其PPO進(jìn)行分離純化和部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為控制香菜褐變提供一定理論依據(jù)，從而提高其經(jīng)濟(jì)價值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

香菜，購于重慶市北碚區(qū)天生路永輝超市。

鄰苯二酚（catechol，AR）成都市科龍化工試劑廠；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、牛血清白蛋白美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Bio-Rad公司；DEAE-Sephrose、Superdex-200層析標(biāo)準(zhǔn)品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品美國GE公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺瑞士Fluka公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

AL204精密電子天平、Seven Easy pH計瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q plus純水儀美國Millipore公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)長沙湘儀儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計日本島津公司；AKTA Prime plus純化系統(tǒng)美國GE公司；MC4L冷凍干燥機(jī)德國Uni-Equip公司；垂直電泳槽和電泳儀美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1香菜葉PPO粗酶液的制備

取新鮮香菜葉片用去離子水洗凈擦干后稱取50.00 g剪碎，按照1∶4（m/V）加入已經(jīng)預(yù)冷的50 mmol/L pH 6.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉抽提緩沖液（其中加入2.00 g 的PVPP）；放入組織勻漿機(jī)中打碎，置4 ℃冰箱抽提2 h，用4 層紗布過濾，在4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，取其上清液即為粗酶液[12-13]。

1.3.2硫酸銨分級鹽析

測定粗酶液體積，置于恒溫磁力攪拌器上，向其中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至30%飽和度，4 ℃冰箱靜置鹽析2 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心45 min收集上清液；然后向收集的上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨粉末至70%飽和度，4 ℃冰箱靜置鹽析3 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心45 min收集沉淀[14]；沉淀用預(yù)冷的50 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖液完全溶解，用5 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl透析液4 ℃條件下透析24 h，透析后得到酶液保存于－20 ℃?zhèn)溆肹12]。

1.3.3DEAE-Sepharose離子交換層析

DEAE-Sepharose離子交換層析柱先用50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液平衡，取透析后的酶液5 mL上樣，用含有0～1.0 mol/L NaCl的50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集時間為700 min，每管收集5 mL，流速設(shè)定為0.5 mL/min，測定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的幾管[13]，4 ℃條件下用超純水透析24 h除鹽后冷凍干燥備用[12]。

1.3.4Superdex-200凝膠過濾層析

Superdex-200凝膠過濾層析柱經(jīng)過50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液處理后，取1.3.3節(jié)冷凍干燥后的酶用50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液溶解后上樣5 mL，用50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，收集時間為500 min，每管收集3 mL，流速設(shè)定為0.3 mL/min，測定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的幾管，用超純水透析后冷凍干燥得到酶的純品，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹12]。

1.3.5PPO活力的測定

參照文獻(xiàn)[12]的方法并略作略改。向試管中加入2.0 mL 50 mmol/L pH 6.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液和底物1.5 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚溶液，于30 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，再加入200 μL酶液，混勻后立即在408 nm波長處測定光密度（OD408 nm）值，以去離子水代替酶液作為對照調(diào)零，酶液加入后開始計時，每30 s記錄1 次OD408 nm值，記錄2 min內(nèi)的變化值，以最初直線段的斜率計算酶活力。酶活力單位定義為：在測定條件下，反應(yīng)后使每分鐘光密度值增加0.001所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.6蛋白質(zhì)含量測定

采用紫外分光光度法[15]以及考馬斯亮藍(lán)G-250法對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定[16]。

1.3.7PPO純度鑒定以及分子質(zhì)量測定

用SDS-PAGE對凝膠過濾后的酶樣品進(jìn)行純度鑒定以及亞基分子質(zhì)量的測定[17]，凝膠過濾法對全酶分子質(zhì)量進(jìn)行測定[18]。

1.3.8香菜葉PPO部分理化性質(zhì)的研究

1.3.8.1香菜葉PPO最適溫度和最適pH值測定

分別在20～75 ℃和不同pH值條件下測定酶活力，以最適條件下測定的酶活力為100%，其余條件下測定的酶活力與之相比得到相對酶活力。

1.3.8.2香菜葉PPO熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性測定

分別在25～75 ℃和pH 3.0～8.0條件下，處理1～5 h，每隔1 h測定酶活力。分別以35 ℃和pH 6.5條件下的酶活力為100%，其他條件下均為相對酶活力。

1.3.8.3香菜葉PPO米氏常數(shù)（Km）測定

在最適溫度和最適pH值條件下，以不同底物濃度鄰苯二酚（0.020、0.025、0.040、0.050、0.080、0.100 mol/L），測定PPO的活力，采用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）[19]求出該酶的Km值。

1.3.8.4不同有機(jī)溶劑對香菜葉PPO活性的影響

分別將異丙醇、乙醇、甲醇和氯仿與酶液混合，混合后有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%，4 ℃條件下處理30 min后，在最適條件下分別測定其活力。以酶在最適條件下測得酶活力為100%，加入不同有機(jī)溶劑后測得的酶活力與之相比得相對酶活力。

1.3.8.5 不同化合物對香菜葉PPO活性的影響

將尿素[12]、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）[20]、檸檬酸[20]配成100 mmol/L母液，按一定的比例與酶液混合，混合后終濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L；抗壞血酸[20]配成5 mmol/L母液，同樣處理，混合后終濃度分別為0.000 5、0.001 0、0.001 5、0.002 0、0.002 5 mol/L，在4 ℃條件下處理30 min后，在最適條件下分別測其活力。以酶在最適條件下測得酶活力為100%，加入不同化合物后測得的酶活力與之相比得相對酶活力。

1.3.8.6 不同金屬離子對香菜葉PPO活性的影響

將各種金屬離子[6,10]配成10 mmol/L母液，再按一定比例分別與酶液混合，混合后終濃度分別為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mol/L，在4 ℃條件下處理30 min后，在最適條件下分別測其活力。以酶在最適條件下測得酶活力為100%，加入不同金屬離子后測得的酶活力與之相比得相對酶活力。

2　結(jié)果與分析

2.1香菜葉PPO的分離純化

圖1　香菜葉PPO的DEAE-Sepharose離子交換柱層析圖Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of PPO from coriander leaves

圖2　香菜葉PPO的Superdex-200凝膠過濾層析圖Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of PPO from coriander leaves

經(jīng)硫酸銨分級沉淀透析后的酶液經(jīng)DEAE-Sepharose層析結(jié)果見圖1，酶活性峰有2 個，第1個酶活性峰出現(xiàn)在第15管，第2個酶活性峰出現(xiàn)在第49管。收集第二個酶活性峰中酶活力較高的幾管，透析并冷凍干燥后上Superdex-200層析柱，結(jié)果見圖2。酶活力最高峰出現(xiàn)在第30管，收集酶活力最高峰對應(yīng)管中樣品，冷凍干燥后于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。整個分離純化過程結(jié)果見表1。

表1　香菜葉PPO的分離純化結(jié)果Table 1 Purification of PPO from corianderleaves

2.2香菜葉PPO的純度和分子質(zhì)量

圖3　香菜葉PPO的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of purified PPO from coriander leaves

由圖3可知，香菜葉PPO純化后，經(jīng)SDS-PAGE顯示單一條帶，說明該酶樣品達(dá)到電泳純，通過遷移率推算出該酶亞基的分子質(zhì)量為55.60 kD；而通過凝膠過濾層析法測定的全酶分子質(zhì)量約為111.10 kD（圖4），可以推斷出香菜葉PPO是由兩個相同的亞基組成。

圖4　Superdex-200凝膠過濾法測定香菜葉PPO的全酶分子質(zhì)量Fig.4 Estimation of molecular weight of PPO from coriander leaves by Superdex-200 gel filtration chromatography

2.3香菜葉PPO部分理化性質(zhì)

2.3.1 香菜葉PPO的最適溫度和最適pH值

圖5　溫度對香菜葉PPO活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of PPO from coriander leaves

圖6　pH值對香菜葉PPO活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of PPO from coriander leaves

由圖5、6可知，該酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適反應(yīng)pH值為6.5。

2.3.2 香菜葉PPO熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性

圖7　香菜葉PPO的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of PPO from coriander leaves

圖8　香菜葉PPO的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of PPO from coriander leaves

由圖7可知，香菜葉PPO在25～45 ℃范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在65～75 ℃酶活力迅速降低，其中75 ℃保溫1 h后酶活力完全喪失。由圖8可知，在pH 6.0～7.0時酶穩(wěn)定性較好，酶活力變化趨勢比較平緩；當(dāng)pH＜4.0或者＞7.0時，酶蛋白分子結(jié)構(gòu)受到破壞，酶活力迅速下降，當(dāng)pH 3.0時，1 h后酶活力完全喪失，當(dāng)pH值為8.0時，3 h后酶活力僅保留13.33%，說明該酶對酸特別敏感，對堿比較敏感。2.3.3 香菜葉PPO的米氏常數(shù)

圖9　雙倒數(shù)法測定香菜葉PPO的米氏常數(shù)Fig.9 Kmdetermination of PPO from coriander leaves by Lineweaver-Burk plot

由圖9可知，香菜葉PPO對鄰苯二酚的Km值為4.04×10－2mol/L。

2.3.4 不同有機(jī)溶劑對香菜葉PPO活性的影響

圖10　不同有機(jī)溶劑對香菜葉PPO活性的影響Fig.10 Effects of various organic solvents on the activity of PPO from coriander leaves

由圖10可知，該酶在異丙醇、乙醇、甲醇、氯仿作用下，酶活性均受到了強(qiáng)烈的抑制，隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，這種抑制作用越強(qiáng)。特別是氯仿，當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%，酶活性完全喪失。4 種有機(jī)溶劑對該酶的抑制作用強(qiáng)弱依次為氯仿、甲醇、異丙醇和乙醇。

2.3.5 不同化合物對香菜葉PPO活性的影響

圖11　不同化合物對香菜葉PPO活性的影響Fig.11 Effects of various compounds on the activity of PPO from coriander leaves

由圖11可知，隨著化合物濃度的增加，抗壞血酸和檸檬酸對香菜葉PPO均有很強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)抗壞血酸濃度為2.5 mmol/L時，完全抑制該酶的活性，當(dāng)檸檬酸的濃度達(dá)到50 mmol/L時，該酶活力僅剩余約30%。尿素對該酶活性的影響不大，EDTA在0～30 mmol/L濃度范圍內(nèi)對該酶的活性有抑制作用，濃度超過30 mmol/L則對酶活性基本沒有影響。

2.3.6 不同金屬離子對香菜葉PPO活性的影響

圖12　不同金屬離子對香菜葉PPO活力的影響Fig.12 Effects of various metal ions on the activity of PPO from coriander leaves

由圖12可知，不同金屬離子對香菜葉PPO活性有不同的影響。隨著離子濃度的增加，Co2+和Pb2+對酶活性有一定的激活作用，Ba2+、Ca2+、Hg2+對該酶均有較強(qiáng)的抑制作用，其中Hg2+對該酶活性的抑制作用最強(qiáng)烈，當(dāng)Hg2+濃度達(dá)到5 mmol/L時，酶活性幾乎完全喪失。

3　討 論

酶的分離純化是對酶學(xué)研究和提高酶的應(yīng)用價值的基礎(chǔ)和前提。本實驗以香菜葉為材料，經(jīng)過搗碎、沉淀、層析等步驟后，從香菜葉中成功分離純化得到電泳純PPO。與其他材料中分離純化的PPO相比較，本實驗回收率偏低，可能的原因有：該酶的同工酶較多，在透析和離子交換層析等純化過程中丟失了大部分同工酶，離子交換層析后回收率僅有10.02%，在純化方法上還有待進(jìn)一步改進(jìn)。

香菜葉PPO全酶分子質(zhì)量為111.10 kD，單亞基分子質(zhì)量為55.60 kD，高于Lonicera japonica Thunb.（49 kD）[21]、雙孢蘑菇（25.5 kD）[14]和中華蘆薈（54.1 kD）[13]；低于甘薯葉（64.40 kD）[12]和荔枝果皮（76 kD）[22]；與Broccoli florets（51.3～57 kD）[23]相近。PPO分子大小的不同可能因為酚類底物氧化產(chǎn)物的反應(yīng)或酶蛋白本身的分解所致[24]，或者種屬差異造成的。

香菜葉PPO最適反應(yīng)溫度為37 ℃，低于桑葉（40 ℃）[25]，高于鴨梨果肉（25 ℃）[26]、人參果（30 ℃）[19]，該酶在25～45 ℃活性較穩(wěn)定，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報道的相符。最適pH值為6.5，與甘薯葉（pH 6.5）[12]相同，與鴨梨果肉（pH 6.4）[26]相近，稍低于蒲菜（pH 6.8）[20]，高于Artichoke heads（pH 6.0）[27]。說明了不同植物來源的PPO在酶學(xué)性質(zhì)方面存在一定的差異。

Ba2＋、Ca2＋、Hg2＋對香菜葉PPO均有較強(qiáng)的抑制作用，可能由于它們能夠與活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，且作為重金屬離子，高濃度會使PPO變性而達(dá)到抑制作用[6]。Co2＋和Pb2＋對該酶活性有一定的激活作用，它們可能能夠促進(jìn)底物與酶活性中心的親和，進(jìn)而有利于PPO的催化反應(yīng)，實現(xiàn)激活效應(yīng)[6]。這與已報道的中華壽桃[10]中Ca2＋對PPO有促進(jìn)作用不一致，表明了同一種金屬離子對不同來源的PPO活性可能有不同的影響。

香菜葉PPO活性受到有機(jī)溶劑氯仿、甲醇、乙醇和異丙醇較強(qiáng)的抑制作用，主要原因是加入有機(jī)溶劑后破壞了該酶的水化層，降低了溶液的極性，使酶分子中維持構(gòu)象的次級鍵被破壞，從而改變了酶的構(gòu)象[12]。其中氯仿的抑制作用最強(qiáng)烈，推測可能原因是氯仿與酶液接觸后會迅速導(dǎo)致分層，加速酶的變性失活?；衔镏锌箟难釋υ撁傅囊种谱饔米顝?qiáng)，這可能是由于抗壞血酸可作為酶分子中銅離子的螯合劑，抑制酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生，另外過多的抗壞血酸可作為醌的還原劑，將體系中原有的醌類還原為無色物質(zhì)[8]。檸檬酸對該酶的抑制作用較強(qiáng)，檸檬酸對PPO的抑制作用在于它的3 個羥基對PPO的銅有螯合作用[9]。

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Isolation, Purification and Enzymatic Characterization of Polyphenol Oxidase from Coriander Leaves

SUN Caiyun, FANG Ling, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet-Potato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract:Electrophoretically pure polyphenol oxidase (PPO) from fresh coriander leaves was obtained through homogenization, buffer solution extraction, ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration chromatography. The specific activity of purified PPO was 5 622.95 U/mg with a recovery of 3.90% and a purification factor of 126.08. The molecular weights of this enzyme and its subunits were 111.10 and 55.60 kD, respectively. It was relatively stable in the range of 25–45 ℃ and pH 6.0–7.0. Its optimum temperature and pH were 37 ℃and 6.5, respectively. Furthermore, its Kmwas 4.04 × 10-2mol/L under the optimum conditions. Its activity was inhibited by methanol, ethanol, isopropanol, trichloromethan, citric acid and ascorbic acid as well as some metal ions such as Ca2+, Hg2+and Ba2+, but was activated by Co2+and Pb2+.

Key words:coriander leaves; polyphenol oxidase; isolation and purification; characterization

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507020

中圖分類號：Q946.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0105-06

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn

作者簡介：孫才云（1988—），男，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：suncai1237@126.com

基金項目：重慶市科委重點攻關(guān)項目（CSTC2011AB1027）

收稿日期：2014-06-19