郝淑賢，魏 涯，周婉君，楊賢慶，李來好，胡 曉，林婉玲，鄧建朝

（中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

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鯖魚生物胺生成菌的分離與鑒定

郝淑賢，魏 涯，周婉君，楊賢慶，李來好，胡 曉，林婉玲，鄧建朝

（中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

摘 要：從鯖魚體內(nèi)分離7 株生物胺產(chǎn)生菌，其中3 株菌可以產(chǎn)生色胺，4 株菌可以產(chǎn)生2-苯乙胺，4 株菌可以產(chǎn)生腐胺，1 株菌可以產(chǎn)生尸胺，3 株菌可以產(chǎn)生組胺，1 株菌可以產(chǎn)生酪胺。組胺生成量較高的No.1菌株形態(tài)學、生理生化分析及菌種鑒定結(jié)果表明該菌株極有可能為侵肺巴斯德氏菌，可信度為99.9%。

關(guān)鍵詞：鯖魚；生物胺產(chǎn)生菌；組胺；生化特性

鯖魚又名青花魚，是一種常見的可食用魚類，多見于西太平洋及大西洋海岸附近，喜群居。鯖魚平均體長30～50 cm，壽命最長可達11 年，它以浮游生物及鱘魚、鱈魚和鯡魚所產(chǎn)魚卵為生，屬于青皮紅肉魚類。近年來先后在江蘇及天津等地發(fā)現(xiàn)鯖魚生物胺中毒事件[1-2]。

組胺是含咪唑環(huán)化合物，在附著在魚肉中的摩氏摩根氏菌，磷發(fā)光桿菌等微生物來源的組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）的作用下，使組氨酸脫去羧基而產(chǎn)生組胺[3-5]。游離氨基酸是生物胺產(chǎn)生的前體物質(zhì)，水產(chǎn)品中游離氨基酸的量和種類對氨基酸脫羧酶的活力都會產(chǎn)生影響[6]。其中組胺是引起過敏性食物中毒的最主要化學物質(zhì)，是人們對海水魚類安全問題關(guān)注的熱點[7]。

生物胺產(chǎn)生菌普遍存在于海水魚的體表及活魚的鰓和內(nèi)臟中，在魚體存活時對魚體并不產(chǎn)生危害[8]。魚體一旦死亡，隨著防御系統(tǒng)被破壞，生物胺產(chǎn)生菌在適宜溫度下迅速繁殖并產(chǎn)生大量組胺。基于鯖魚頻繁引起生物胺特別是組胺中毒現(xiàn)象，本實驗通過研究篩選生物胺產(chǎn)生菌，對分離菌的形態(tài)特征、生物胺生成情況進行分析，為鯖魚貯藏過程中生物胺的形成及控制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料

冰鮮鯖魚購于廣州市海珠區(qū)下渡路水產(chǎn)市場，經(jīng)去頭、去內(nèi)臟、無菌包裝后于室溫下（18～23 ℃）存放備用。

1.1.2 試劑

生物胺標準品：組胺（h i s t a m i n e，H I S）（≥97%）、色胺（tryptamine，TRP）（≥98%）、2-苯乙胺（2-phenethylamine，2-PHE）（≥99.5%）、尸胺（cadaverine，CAD）（≥97%）、腐胺（putrescine，PUT）（≥99%）、亞精胺（spermidine，SPM）（≥98%）、精胺（spermine，SPD）（≥97%）、酪胺（tyramine，TYR）（≥99%）、丹磺酰氯（99%）、1,7-二氨基庚烷（98%） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇、丙酮均為色譜純 美國Burdick & Jackson公司；其他試劑均為化學純或分析純，購于廣州粵申化學試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

PCA培養(yǎng)基（1 L）：準確稱取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15 g，加入1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2。

生物胺篩選培養(yǎng)基（1 L）：準確稱取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉5.0 g、L-組氨酸18.5 g、氯化鈉5.0 g、碳酸鈣1.0 g、瓊脂20 g和溴甲酚紫0.06 g，使用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至5.3±0.2。

TSA培養(yǎng)基（1 L）：稱取47 g干粉于1 L蒸餾水中加熱煮沸溶解，滅菌后制成平板備用。

TSBH培養(yǎng)基（1 L）：準確稱取TSB培養(yǎng)基38 g和L-組氨酸20 g，加入1 L蒸餾水，煮勻，滅菌后使用；以上培養(yǎng)基于1.01×105Pa高壓下121 ℃蒸汽滅菌15 min。

1.1.4儀器與設(shè)備

TU-1990紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；3K30型冷凍離心機 美國Sigma公司；388型立式蒸汽壓力滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；WGP-350隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海華巖儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1 菌落總數(shù)的測定

參考盧涵等[9]的方法測定菌落總數(shù)。取常溫貯藏0、1、2、3、4、5 d的鯖魚背部肌肉組織，無菌條件下?lián)v碎混勻，稱取10 g置于裝有90 mL生理鹽水的錐形瓶中（內(nèi)含滅菌玻璃珠），混勻。用無菌生理鹽水依次稀釋成10 倍系列稀釋樣品勻液，無菌條件下進行PCA培養(yǎng)基平板稀釋實驗。

1.2.2 菌株的分離與純化

參考楊健等[10]的方法，將上述樣品稀釋液在無菌條件下在生物胺篩選培養(yǎng)基上進行平板涂布實驗，然后將涂布后的培養(yǎng)基置于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，肉眼觀察生物胺篩選培養(yǎng)基上的菌落，藍紫色菌落即為生物胺產(chǎn)生菌。用接種環(huán)將培養(yǎng)基中的藍紫色菌落接種于TSA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，35 ℃培養(yǎng)2 d。

1.2.3 菌株生長狀況及生物胺生成情況

將純化后的細菌接種于TSBH培養(yǎng)基中，分別置于4 ℃和35 ℃環(huán)境中振蕩培養(yǎng)2 d，用紫外分光光度計連續(xù)測定培養(yǎng)液的OD605 nm值，表示各細菌的生物量。參考楊賢慶等[11]的方法，取1 mL 35 ℃條件下培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液，采用柱前衍生高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對組胺（HIS）、色胺（TRP）、2-苯乙胺（2-PHE）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、酪胺（TYR）、亞精胺（SPD）和精胺（SPM）8 種生物胺進行測定分析，實驗重復3 次。

色譜測定參數(shù)：色譜柱：Grace Smart RP-18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，熒光激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為520 nm。流動相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈，流動相C為超純水。梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序表Table 1 HPLC ggrradient elution program for biogenic amine analysis

1.2.4 生化實驗

1.2.4.1 菌落形態(tài)及色澤觀察

觀察并描述單菌落在平板上的形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等菌落特征。

1.2.4.2 革蘭氏染色

挑取菌落，進行革蘭氏染色實驗，用顯微鏡觀察菌體的革蘭氏染色情況。

1.2.4.3 菌種鑒定

挑取單菌落分別接種于3 mL質(zhì)量分數(shù)0.45%無菌NaCl溶液（pH 4.5～7.0）中，混勻，配制相當于0.80～0.10麥氏單位的菌懸液，使用VITEK 2全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定[12]。

2　結(jié)果與分析

2.1菌落總數(shù)測定結(jié)果

圖1　鯖魚在常溫貯藏過程中菌落總數(shù)的變化情況Fig.1 Changes in total bacterial counts in mackerel during storage at normal temperature

由圖1可知，貯藏初期，鯖魚體內(nèi)的細菌總數(shù)為3.41 （lg（CFU/g）），在貯藏第2天時，鯖魚體內(nèi)的細菌總數(shù)為8.74 （lg（CFU/g）），而后鯖魚體內(nèi)的細菌進入穩(wěn)定期。

2.2菌株的分離與純化

取貯藏2 d后的鯖魚樣品，進行生物胺生成菌株的分離、鑒定。因目前國內(nèi)外研究學者還未研制出直接篩選組胺菌的培養(yǎng)基。組胺生成菌分離瓊脂（histamineforming bacteria isolation agar，HBI）培養(yǎng)基是最早用來分離產(chǎn)組胺細菌的培養(yǎng)基，由美國研究學者Niven等[13]研制。但是隨著科技的不斷進步，研究者們發(fā)現(xiàn)HBI培養(yǎng)基分離的菌種不僅僅是組胺產(chǎn)生菌，還有其他生物胺產(chǎn)生菌[14-16]，本研究根據(jù)生物胺改變pH值的原理利用HBI培養(yǎng)基對生物胺生成菌株進行初步的分離篩選。通過初步的分離篩選共得到7 株不同菌落形態(tài)的菌株，它們都能夠使得生物胺篩選培養(yǎng)基變成藍紫色，見圖2。

圖2　生物胺篩選培養(yǎng)基中的菌落Fig.2 Colonies with blue or purple color on BA-forming bacterium isolation agar

2.3菌株生長狀況分析

圖3　7 株細菌在4 ℃（a）及35 ℃（b）的生長曲線Fig.3 Growth curves of seven strains at 4 ℃ (a) and 35 ℃ (b)

將分離的7 株細菌接種到TSA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)后，確定7 株細菌在4 ℃和35 ℃條件下的生長曲線，結(jié)果如圖3所示。7 株細菌在4 ℃條件下OD605 nm值增長緩慢，培養(yǎng)5 d期間OD605 nm值低于0.03。在35 ℃條件下培養(yǎng)2 d，每隔2 h測定一次OD605 nm值，可以看出7 株細菌在35 ℃條件下OD605 nm值增長迅速，特別是在培養(yǎng)4～12 h期間，7 株菌株的OD605 nm值呈對數(shù)增長，培養(yǎng)約12 h后菌株OD605 nm值趨于穩(wěn)定，而后增長速率緩慢，No.1菌株OD605 nm值增長最大，在培養(yǎng)48 h后OD605 nm值為1.96。結(jié)果表明7 種菌株在35 ℃條件下生物量變化比較明顯。文獻[17]報道，生物胺生成菌適宜生長溫度范圍主要分3 種，分別為嗜冷菌（低于20 ℃）、嗜溫菌（25～40 ℃）和嗜熱菌（高于40 ℃），Mackie等[17]認為導致魚體腐敗形成生物胺的菌株主要是嗜溫菌。

2.4生物胺生成情況分析

通過對TSBH培養(yǎng)液中細菌代謝物的檢測，7 株細菌在35 ℃時有生物胺檢出，在4 ℃時無生物胺檢出。7 株細菌在35 ℃條件下生物胺的產(chǎn)生情況如表2所示。在7 株細菌中，有3 株細菌可以產(chǎn)生色胺，有4 株細菌可以產(chǎn)生2-苯乙胺，有4 株細菌可以產(chǎn)生腐胺，有1 株細菌可以產(chǎn)生尸胺，有3 株細菌可以產(chǎn)生組胺，有1 株細菌可以產(chǎn)生酪胺。雖然No.6、No.7菌株可以產(chǎn)生組胺，但是組胺產(chǎn)生量相對較少，而No.1菌株產(chǎn)生的生物胺含量較高，因此繼續(xù)對No.1菌株進行鑒定。

表2　7 株細菌的生物胺產(chǎn)生情況Table 2 Biogenic amine Contents produced by seven strains

2.5菌株鑒定

2.5.1 形態(tài)學觀察結(jié)果及革蘭氏染色結(jié)果

通過觀察平板上單菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)No.1菌株菌落為淡黃色，圓形，濕潤光滑，邊緣整齊。革蘭氏染色結(jié)果確定為革蘭氏陰性細菌。通過顯微鏡觀察為G－桿菌。

2.5.2 No.1菌株鑒定

表3　No.1菌株的鑒定結(jié)果Table 3 Identification of strain No.1

No.1菌株生理生化指標見表3，結(jié)果表明該菌株D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露糖及蔗糖反應為陽性，其他指標反應為陰性。API（32E）鑒定No.1菌株可能為侵肺巴斯德氏菌，可信度為99.90%。

3　結(jié) 論

本研究利用生物胺生成改變pH值的原理，通過HBI培養(yǎng)基對生物胺生成菌進行初步篩選，共從鯖魚體內(nèi)分離出疑似菌株7 株。各菌株生成生物胺的種類與含量存在很大差異，其中以No.1菌株組胺生成量最多，總生物胺生成量最高，種類最豐富，通過形態(tài)學、生理生化指標分析鑒定，確認No.1菌株與侵肺巴斯德氏菌的可信度為99.9%。趙中輝等[18]在鲅魚魚肉中檢測到該菌株，并且確認其與組胺等生物胺生成有關(guān)。該菌屬于巴斯德氏菌屬，在4 ℃生長緩慢，35 ℃生長良好，說明該菌為嗜溫菌。說明細菌對生物胺的產(chǎn)生非常重要，因此預防組胺中毒最有效的方法是防止細菌污染，有效控制細菌生長。

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Isolation and Identification of Biogenic Amine-Producing Bacteria in Mackerel

HAO Shuxian, WEI Ya, ZHOU Wanjun, YANG Xianqing, LI Laihao, HU Xiao, LIN Wanling, DENG Jianchao
(National R&D Center for Aquatic Product Processing, Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

Abstract:Seven biogenic amine-producing strains were isolated and purified from mackerel. The results showed that three of the strains produced serotonin, four produced 2-phenylethylamine, four generated putrescine, one produced cadaverine, three produced histamine, and one produced tyramine. Strain 1 that produced a higher amount of histamine than other strains was identified as lung Pasteurella pneumotropica with a reliability of 99.9% by analysis of morphological and physio-chemical properties.

Key words:mackerel; biogenic amine-producing bacteria; histamine; physio-chemical properties

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507018

中圖分類號：TS201.6

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0097-04

作者簡介：郝淑賢（1972—），女，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。E-mail：susanhao2001@163.com

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B05）

收稿日期：2014-01-20